目的脓毒症是由感染因素所致的全身炎症反应,发病急,病情发展迅速,病死率高的危重疾病,由于病情复杂,难于控制。革兰氏阴性菌细胞壁外膜中的脂多糖(LPS)是引起炎症反应的主要致病因子,对LPS介导的毒性反应一直是人们研究的热点。众多研究表明,Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)介导的天然免疫在LPS诱导的炎症反应中起着重要作用,与LPS刺激信号向细胞内传递过程关系密切,现已证实多种致炎细菌成分都直接或间接激活TLR2和TLR4,继而使白细胞活化。因此,阻断或抑制TLR2和TLR4的激活有可能抑制白细胞的活化,阻断白细胞炎性介质的合成与分泌,有可能抑制过度的炎症反应。本课题组前期制备的重组腺病毒AdTLR2,能够竞争抑制白细胞膜上TLR2的活化,进而抑制细胞炎性因子的表达水平,显示出一定的抗炎作用。在此基础上构建人TLR4胞外区重组腺病毒AdTLR4,观察重组腺病毒AdTLR2和AdTLR4联合作用于LPS所致细胞体外模型和动物体内模型的抗炎效果,为临床炎症治疗提供新思路。方法1.克隆构建登陆NCBI网站,查找TLR4基因的mRNA序列,利用Oligo软件设计TLR4胞外区引物,以pUCm-TLR4质粒为模板,运用PCR技术扩增人TLR4胞外区目的基因片段。将目的基因克隆至pTA2载体上构建重组质粒,通过酶切分析及测序结果鉴定。2.构建重组腺病毒将测序正确的TLR4胞外区基因片段克隆至腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV上,构建重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV-TLR4。PmeⅠ酶切线性化阳性克隆,在BJ5183菌内完成与骨架质粒pAdEasy-1的同源重组以构建重组腺病毒质粒pAd-TLR4。将鉴定正确的重组质粒通过脂质体介导在293细胞内进行包装并大量扩增病毒,纯化并测定病毒滴度。RT-PCR方法及Western blot鉴定重组腺病毒表达活性。3.观察重组腺病毒对经LPS处理的THP-1细胞炎症细胞因子水平的影响将人单核细胞系THP-1细胞随机分为五组:A组(正常对照组)、B组(炎症对照组:使用LPS刺激细胞)、C组(重组腺病毒AdTLR2组:LPS刺激细胞之前用腺病毒感染细胞)、D组(重组腺病毒AdTLR4组:LPS刺激细胞之前用腺病毒感染细胞)、E组(重组腺病毒AdTLR2+AdTLR4组:LPS刺激细胞之前用腺病毒感染细胞)。24h后离心收集细胞悬液,应用酶联免疫吸附实验(ELISA)对细胞上清液中细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10和IL-13的含量进行检测,探讨AdTLR2和AdTLR4对LPS诱导的THP-1细胞上清细胞因子水平的影响。4.观察重组腺病毒对LPS所致炎症小鼠炎症细胞因子水平的影响30只BALB/c小鼠随机分成五组:A组(正常对照组:通过腹腔注射生理盐水)、B组(炎症对照组:通过腹腔注射LPS溶液)、C组(重组腺病毒AdTLR2组:LPS致炎成分之前腹腔注射病毒悬液)、D组(重组腺病毒AdTLR4组:LPS致炎成分之前腹腔注射病毒悬液)、E组(重组腺病毒AdTLR2+ AdTLR4组:LPS致炎成分之前腹腔注射病毒悬液)。对小鼠进行24h大体观察(观察小鼠身体特征和生活习性的变化)后,眼眶取血,分离血清,应用酶联免疫吸附实验(ELISA)对血清中细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10和IL-13的含量进行检测,分析AdTLR2和AdTLR4对小鼠血清细胞因子水平变化的影响。结果1.获取了人TLR4胞外区目的基因片段运用PCR技术成功获取人TLR4胞外区目的基因片段,并成功构建重组质粒pTA2-TLR4。序列分析结果表明,本实验所克隆的目的片段长度为1900bp,与GenBank中人TLR4胞外区基因序列完全吻合。2.构建了重组腺病毒经酶切及测序鉴定,重组腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV-TLR4构建成功。重组腺病毒质粒经PacI酶切后可见一条约30kb大小的条带和一条4.5kb的条带,表明同源重组成功。将线性化的重组腺病毒质粒pAd-TLR4转染293细胞后于荧光显微镜下可见明亮的绿色荧光,出现典型的细胞病变效应(CPE),说明重组腺病毒包装成功。扩增后收集病毒,纯化获得3.2×109 PFU/mL的重组腺病毒AdTLR4,经RT-PCR及Western blot检测表明感染后细胞中均有TLR4基因表达。3.重组腺病毒对LPS作用的THP-1细胞分泌炎症细胞因子的影响AdTLR2或者AdTLR4单独作用于LPS所致炎症细胞后,细胞上清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10和IL-13的含量较炎症对照组显著降低,不同因子降低的程度不同。AdTLR2+AdTLR4联合作用后,上述细胞因子含量较单独作用组进一步降低,具有统计学意义(P<0.05)。4.重组腺病毒对LPS所致炎症小鼠炎症细胞因子水平的影响正常对照组小鼠无明显变化;炎症对照组小鼠注射LPS后活动明显减少,食欲减退,蜷缩无力,毛发无光泽;单独重组腺病毒组和联合作用重组腺病毒组小鼠腹腔注射腺病毒后初期活动较少,食欲略减少。AdTLR2或AdTLR4单独作用LPS所致炎症小鼠后,血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10和IL-13的含量较炎症对照组显著降低,不同因子降低的程度不同。而AdTLR2+AdTLR4联合作用后,上述细胞因子含量较AdTLR2或AdTLR4单独作用组进一步降低,具有统计学意义(P<0.05)。结论1.成功获取人TLR4胞外区目的基因片段,经测序及同源性分析表明与GenBank中人TLR4胞外区基因序列完全吻合。2.成功构建了人TLR4胞外区基因的重组腺病毒AdTLR4,经293细胞包装、扩增及纯化,获得3.2×109 PFU/ml的高滴度重组腺病毒。3.在细胞水平,重组腺病毒AdTLR2和AdTLR4能够降低LPS所致炎性细胞上清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10和IL-13的含量,二者联合使用的抗炎效果优于AdTLR2或AdTLR4的单独作用,提示制备的重组腺病毒能够分泌sTLR2和sTLR4,能够有效抑制炎性细胞的活化,从而减少细胞因子的释放,具有一定的抗炎作用。4.在体内重组腺病毒AdTLR2和AdTLR4能够降低LPS所致炎症小鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10和IL-13的含量,二者联合使用炎症因子的降低程度要低于AdTLR2或AdTLR4单独作用,二者联合使用的抗炎效果优于单独使用其中之一,提示制备的重组腺病毒在动物体内可以分泌sTLR2和sTLR4能够抑制血清中炎症细胞因子的表达水平,具有一定的抗炎作用。此在国内外尚未见报道。