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本研究以人TMCO1基因(GenBank accession number NM_019026)为种子,在猪EST库中BLAST检索,通过电子克隆的方法,拼接猪TMCO1基因序列。并通过分子克隆的方法,设计特异引物将猪TMCO1基因完整开放阅读框ORF区克隆,测序,长度为735个碱基,包含长度为567个碱基的完整开放阅读框,111个碱基的5’非编码区(UTL)。提交NCBI数据库,序列号:FJ440337,蛋白ID:ACN82430。该基因编码188个氨基酸,分子量21.2 kDa,等电点9.77。
通过对猪TMCO1基因生物信息学预测,我们发现其位于猪4号染色体,具有7个外显子,6个内含子。TMCO1蛋白是DUF841未知功能真核蛋白超家族的成员之一。猪TMCO1蛋白与NCBI GenBank中的许多物种的TMCO1蛋白有着相当高的同源性,预示着其功能的重要性。预测TMCO1蛋白在24-25氨基酸的位置有信号肽。不同的网站对于猪TMCO1蛋白的跨膜区域有着不同的预测,有的认为有一个跨膜区域,有的认为有两个,有的认为有三个。究竟猪TMCO1蛋白的定位机制如何,我们设计实验加以验证。
采用辐射杂交板技术IMpRH,我们将猪TMCO1基因定位在猪4号染色体72cM处,微卫星标记SW1364附近。通过NCB1数据库,我们发现微卫星标记SW1364与猪肌内脂(IMF),平均日增重密切相关,进一步验证了我们生物信息学预测的结果。
采用融合报告基因定位法,我们研究了猪TMCO1蛋白在猪肾上皮细胞(PK15)各种细胞器:细胞核,线粒体,内质网,高尔基体,溶酶体,细胞骨架中的定位情况。我们发现猪TMCO1蛋白在猪肾上皮细胞(PK15)中定位在线粒体中。为了进一步研究猪TMCO1蛋白的定位机制,我们构建了缺失预测的第一段跨膜区(1-29个氨基酸)的重组质粒和缺失预测的第一、二段跨膜区(1-109个氨基酸)的重组质粒转染PK15细胞,对照含有完整TMCO1编码区重组质粒转染PK15细胞。我们发现缺失预测的第一段跨膜区之后的蛋白仍然定位在线粒体,而缺失预测的第一、二段跨膜区之后的蛋白不再定位在线粒体这说明猪TMCO1蛋白有两跨膜区,并且只有两个,它们分别是7-29个氨基酸和91-109个氨基酸两段氨基酸序列。
采用荧光实时定量PCR技术,我们研究了猪TMCO1基因在大脑,心脏,肝脏,脾脏,胃,肾脏,肺,淋巴,大肠,小肠,背最长肌和脂肪12个组织中的表达情况。我们发现猪TMCO1基因在心脏,肝脏,肾脏组织中表达量最高,在背最长肌,脂肪,大脑,肺,大肠,小肠,淋巴组织中表达量较高,而在脾脏,胃中表达量较低。
采用荧光实时定量PCR技术,我们研究了小鼠TMCO1基因在热休克反应处理小鼠C2C12肌原细胞株中的表达情况。我们发现小鼠TMCO1基因在小鼠C2C12肌原细胞置于43℃的水浴箱中热处理0.5h后,置37℃,5%CO2培养箱中培养3小时后表达明显增高(p<0.05)。
采用荧光实时定量PCR技术,我们研究了小鼠TMCO1基因在脂多糖(LPS)处理小鼠巨噬细胞株RAW264.7中的表达情况。我们发现小鼠TMCO1基因在用LPS(1μg/ml)对小鼠巨噬细胞株RAW264.7细胞进行12小时刺激后表达明显增高(p<0.05)。
克隆了TMCO1基因的启动子序列,生物信息学分析发现,TMCO1基因启动子序列中有KLF4转录因子结合位点,并通过凝胶阻滞电泳迁移率实验(EMSA)验证TMCO1基因确实为KLF4转录因子的靶基因。