生物法生产新型抗氧化剂2-O-β-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸的研究

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本论文建立了高效液相色谱法检测2-O-β-D-葡萄糖基-L-抗坏血酸的方法。该方法色谱条件为:Agilent Zorbax SB-Aq色谱柱(5μm,4.6mm×150 mm);流动相为含0.08%三氟乙酸的水溶液;流速:1.0 mL/min;柱温:30℃;检测器为DAD检测器,检测波长236 nm;进样量:20μL。在日本学者研究的基础上有效简化分离纯化步骤,粉碎枸杞干果,浸提后采用FPLC提取到纯度较高的AA-2βG。FPLC条件如下:色谱柱:HiPrepTM16/10 Q XL;流动相:5%醋酸;流速u:5.0 mL/min;上样量:10mL/次;紫外检测波长λ:254 nm。实验比较酶的分离纯化方法,提取枸杞中可能有糖基转移活性的酶,进行转化试验,经检测发现,最终获得的酶中,无一具有糖苷转移活性。从产纤维素酶菌种中筛选到产糖苷转移酶的菌种,提取粗酶进行转化,LC/MS检测转化液、枸杞提取物和标样,确定转化液中含有和标样相同分子量的物质,枸杞提取物中的主要物质也与标样分子量一致,三者分子量均为338。通过DPPH自由基清除法发现,1min内抗坏血酸清除自由基效果迅速,之后趋势减缓,此时AA-2βG的清除优势开始显现,而转化液中同步合成的相同分子量的AA-6βG不具有抗氧化性的,AA-2βG清除自由基的总量大于抗坏血酸,证实了报道中1分子AA-2βG清除大于1分子自由基的说法。在此基础上,对该菌种的发酵产酶条件进行优化,得到以下最佳发酵条件:稻草粉15.0%,麸皮5.0%,(NH42SO4 0.4%,MgSO4 0.012%,1倍CMC的吐温-40,10 mL自来水,pH自然,放入250 mL锥形瓶中,接种量为1 mL培养48 h的种子培养液,32℃下培养4 d。对转化过程中糖基供体浓度、VC浓度、加酶量和转化时间进行优化,初步确立合适的转化条件为:以浓度为40 mg/mL纤维二糖作为葡萄糖基供体,浓度为40 mg/mL的维生素C作为受体,16 mg/mL酶浓度,以pH5.0的醋酸-醋酸钠缓冲液为溶剂,在温度37℃下反应24 h。测定自制纤维素粗酶粉和3种商品纤维素酶中三种酶组分FPA酶、CMC酶和C1酶活,具有糖基转移活性的养乐多纤维素酶和自制纤维素酶的C1酶组分明显高于其余两种商品纤维素酶,这两种商品纤维素酶不能转化合成AA-2βG,推断该组分酶活与糖苷的合成有一定关联,后续研究可改良产该组分酶的基因,提高酶活。
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