玉米大斑病是世界玉米产区主要的真菌性病害之一,该病害主要通过损伤或杀死玉米叶片组织,减少植株的受光面积,降低光合作用效率,进而影响玉米的品质和产量。引起该病害的真菌为玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)。有关病菌侵染玉米的方式和过程已有较多研究,但两者之间相互作用的分子机制尚不明确。本研究以大斑病菌为研究对象,通过对病菌与玉米互作转录组的分析,并结合分子生物学手段,挖掘并验证了一些病菌重要的侵染相关基因;以玉米为研究对象,基于多种组学技术,分析了大斑病菌侵染过程中玉米叶片在转录组、蛋白质组以及磷酸化修饰水平上的变化,深入挖掘了与玉米响应大斑病菌侵染过程密切相关的功能基因和代谢途径,初步探究了玉米与大斑病菌互作过程的分子机制。主要研究结果如下:1.玉米大斑病菌重要侵染相关基因的挖掘与验证(1)通过互作转录组分析发现,共挖掘到583个与大斑病菌侵染密切相关的候选基因,其中包括StPBS2、StMKK1、StHOG1以及StKSS1等7个MAPK基因,STE12在内的1 1个转录因子基因,StSP1和StSP2在内的15个有功能注释的效应因子基因,以及StKU80在内的19个与遗传信息传递相关的基因等。(2)通过对部分重要候选基因进行致病性验证发现,HOG-MAPK途径中的StPBS2沉默或StHOG1敲除导致病菌丧失侵染能力和致病性,且StHOG1还影响了病菌的HT毒素活性;转录因子StSTE12敲除使病菌失去穿透力进而不能侵染致病,但对病菌的毒力没有影响;遗传信息传递相关基因StKU80的敲除也导致病菌不能成功侵染寄主。利用本氏烟瞬时表达系统发现,效应因子StSP1和StSP2能够完全或部分抑制植物免疫反应。以上结果证实了上述基因为玉米大斑病菌的重要侵染相关基因。2.玉米响应大斑病菌侵染的多组学分析(1)通过对病菌侵染的玉米叶片进行RNA-Seq分析发现,与CK(0 hpi)相比,共筛选得到了 7,196个差异表达基因参与了玉米叶片响应大斑病菌侵染过程。对其进行功能分析发现,这些差异表达基因富集到了多条代谢途径,其中苯并恶唑嗪酮类化合物生物合成、四环吡咯生物合成以及光合作用等代谢途径相关基因呈下调表达;而酚类代谢和苯丙烷代谢途径相关基因呈上调表达。包括ZmWAK-RLK1在内的部分与植物免疫应答相关的RLKs、WAKs、NLRs受体基因在大斑病菌侵染的玉米叶片中也被不同程度诱导表达;NAC、MYB_related、HB以及WRKY等转录因子家族基因在差异表达基因中也显著富集。进一步随机选取部分差异表达基因,利用qRT-PCR技术对其表达水平进行验证,结果证实了 RNA-Seq数据的可靠性。(2)利用TMT标记技术对玉米叶片进行定量蛋白质组分析发现,与CK(0hpi)相比,在玉米叶片响应大斑病菌侵染过程中共筛选得到1.331个差异表达蛋白质。对其进行功能注释发现,苯丙酸生物合成、α-亚麻酸代谢、脂肪酸降解、内质网膜蛋白质加工和淀粉与蔗糖的代谢等途径在上调表达蛋白质中显著富集,而苯并恶唑嗪酮类化合物生物合成和光合作用相关途径在72 hpi的下调表达蛋白质中特异富集。另外,有11个与茉莉酸合成相关蛋白质在接种大斑病菌后差异上调表达。进一步选取了 14个差异表达蛋白质进行PRM试验验证,结果证实了蛋白质组数据的可靠性。(3)利用TMT标记技术并结合基于IMAC的磷酸肽富集策略对玉米叶片进行了蛋白质组磷酸化修饰分析,一共检测到1,598个蛋白质的3,416个磷酸化位点,这些位点被富集到了包括17种丝氨酸(S)和4种苏氨酸(T)在内的磷酸化基序。与CK(Ohpi)相比,在大斑病菌侵染的玉米叶片中共筛选得到183个差异磷酸化修饰蛋白质,且磷酸化修饰水平上调的蛋白质多于下调的。功能注释分析发现,磷酸化水平差异的蛋白质具有广泛的功能,主要涉及碳水化合物相关激酶、氧化还原和跨膜转运蛋白活性。(4)通过关联分析发现,筛选得到的差异表达基因在转录水平和蛋白质丰度之间存在显著的正相关(P<0.001),但相关性不高(24 hpi、72 hpi的Pearson相关系数分别为0.26和0.43);而蛋白质丰度和磷酸化水平之间没有明显的相关性。综上所述,玉米与大斑病菌互作是一个复杂的动态生物过程。一方面,病菌的侵染需要包括MAPK信号转导、转录因子和效应因子等许多重要侵染相关基因的参与。另一方面,玉米响应病菌侵染需要大量基因的转录重排、蛋白质的丰度变化以及磷酸化修饰水平的改变,涉及信号转导、“光合作用”和“苯并恶唑嗪酮类化合物生物合成”在内的多条代谢途径。该研究为深入理解大斑病菌与玉米互作的分子机制提供了基础数据。