【摘 要】
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在后基因组时代,随着对蛋白质结构与功能、稀有密码子与高效表达、核酸疫苗、基因芯片、基因治疗等方面的研究深入,人工合成任意DNA序列的需求在逐步升高,但是合成基因中碱基
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在后基因组时代,随着对蛋白质结构与功能、稀有密码子与高效表达、核酸疫苗、基因芯片、基因治疗等方面的研究深入,人工合成任意DNA序列的需求在逐步升高,但是合成基因中碱基的高错误率与昂贵的成本限制了全基因合成方法的应用。本文从合成成本与错误率两方面出发,优化合成方案及合成条件,确定寡核苷酸拆分的最佳长度为55-59bp,重迭15-18bp,重迭片段Tm值不低于50℃,DA-PCR使用四(不超过六)条寡核苷酸为模板、内部引物浓度为25nM、内外引物浓度比为1:8, OE-PCR应用外部引物,降落PCR退火,T7核酸内切酶I处理等手段,使错误率大大降低,有效降低合成成本及操作工作量。通过合成E.coli偏爱密码子编码的hGH基因、IL-18基因、Pichia pastoris偏爱密码子编码的G-CSF基因对优化后的合成方案进行验证,三个基因序列全长分别为1040bp、495bp、546bp,均在有限的克隆中得到全正确序列。本文还创新性的提出了错误碱基的修复方案-寡核苷酸覆盖法,设计巧妙、简单、易行。
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