目的:运用蛋白质组学的方法筛查HT29(BRAF^V600E突变)及HT29-1627(BRAF^V600E沉默)两种细胞株所分泌的外泌体中的差异蛋白,探讨BRAF^V600E突变影响肿瘤微环境的可能机制。方法:1细胞培养及细胞培养液的收集取出已接种好的HT29(BRAF^V600E突变)及HT29-1627(BRAF^V600E沉默)细胞,观察两种细胞的生长状态。当细胞长满细胞培养瓶底部时,进行细胞传代并收集陈旧的细胞培养液备用。2外泌体的提取在4℃下将来自于HT29(BRAF^V600E突变)及HT29-1627(BRAF^V600E沉默)细胞株的陈旧培养液分别于480g离心5min、2000g离心10min、10000g离心1h去除细胞碎片。取上清液在32000rpm离心16h,所得沉淀溶于PBS中,混悬液（外泌体）在-80℃条件下保存备用。3透射电镜对外泌体的形态进行鉴定将混悬液滴于孔径2nm的铜网上,室温下静置3min,从铜网侧边吸干液体后滴加2%磷钨酸溶液30ul,室温下静置5min,待其干燥后,将此铜网置于透射电镜的样品室内,观察外泌体形态并拍摄电子照片。4采用Western blot对外泌体表面标志物进行鉴定将外泌体悬液浓缩后测定其蛋白含量,制备SDS-PAGE凝胶并进行蛋白变性及电泳,结束后转膜并检测外泌体的表面标志物CD63。5对外泌体中的蛋白质进行定量分析并找出差异蛋白首先从两种外泌体样品中提取蛋白质,然后对提取的蛋白样品进行还原烷基化处理并对蛋白浓度进行测定,等体积的蛋白质进行电泳,充分酶解蛋白质后用同重同位素相对与绝对定量试剂标记肽段,进而将表记好的肽段进行等量混合并进行预分离,然后再次进行液相串联质谱分析。每组重复三次。建立数据库,进行肽段及蛋白质的鉴定。依靠GO、KOG等生物信息分析软件对全部的蛋白质进行生物信息分析并找出差异蛋白。结果:1通过透射电镜观察,两种细胞株分泌的外泌体为均一的椭圆形或圆形囊泡,直径在0-100nm之间,可散在分布,也可聚集成团。2通过Western blot对外泌体的表面标志物检测,发现两种细胞株分泌的外泌体表面都有CD63的表达。3通过运用同重同位素相对与绝对技术对两组外泌体中的蛋白质进行检测,共发现279种不同的蛋白质。依靠GO、KOG等生物信息分析软件对全部的蛋白质进行了生物信息分析。进一步定量分析比较后,发现HT29-1627(BRAF^V600E沉默)细胞株来源的外泌体中,21种蛋白质的表达量是下降的,其中组蛋白H4的下降最为显著;1种蛋白质的表达量是上调的。结论:BRAF^V600E突变型结肠癌组蛋白H4和ACTB释放增加,可能影响肿瘤微环境,进而发生进展。