论文部分内容阅读
目的：肺癌是发病率和致死率最高的恶性肿瘤，其中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)所占比率最高。肿瘤细胞自我更新、快速增殖、高侵袭迁移能力等恶性表型是NSCLC局部复发和远处转移的根本原因。因此，深入研究NSCLC恶性表型的维持机制，为阐明NSCLC的发生发展机制，寻找特异性治疗靶点具有重要的意义。研究发现，转录因子SOX2能与Hippo信号通路中的关键效应分子YAP1相互作用促进恶性肿瘤的进展。性别决定区Y框蛋白5(Sex determining region Y-box5，SOX5)同属于SOX超基因家族中的一员，其也异常表达于多种肿瘤并能促进肿瘤细胞的增殖、侵袭迁移等多种恶性表型，但SOX5在NSCLC中的表达情况及其在肿瘤发生演进中发挥的作用目前尚不清楚。因此，本研究旨在探讨SOX5在NSCLC中的表达情况及其在维持NSCLC恶性表型中发挥的作用及其潜在的机制。 方法：在GEO数据库中分析SOX5的表达与NSCLC患者的预后关系，应用定量实时多聚酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)和Western blot检测SOX5在人支气管上皮样细胞（human bronchial epithelial cells，HBE）和3种NSCLC细胞株(A549、H1299、H1975)以及肿瘤球与单层肿瘤细胞中的表达情况。采用慢病毒感染A549和H1975细胞，经qRT-PCR和Western blot验证干扰效率，构建SOX5敲低和过表达稳定细胞株。分别应用克隆形成实验、CCK-8实验、成球试验、transwell细胞侵袭实验、划痕实验和免疫荧光伪足染色探讨敲低和过表达SOX5后对A549和H1975细胞增殖、侵袭和迁移能力的影响，同时采用Western blot探讨敲低和过表达SOX5后对细胞干性标志物OCT4、NANOG、SOX2以及侵袭、迁移相关蛋白MMP2、VIMENTIN、SLUG的影响。进一步在裸鼠皮下注射敲低SOX5-A549细胞建立移植瘤模型，测定瘤体大小和重量，免疫组化检测瘤体内SOX5、YAP1、SOX2和MMP2的表达情况。应用成球试验、transwell细胞侵袭实验、划痕实验和免疫荧光伪足染色探讨YAP1对NSCLC恶性表型的影响，Western blot探讨敲低YAP1后对干性标志物OCT4、NANOG、SOX2以及侵袭、迁移相关蛋白MMP2、VIMENTIN、SLUG的影响。机制上，应用免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation，Co-IP)、细胞免疫荧光染色及核浆分离实验验证与SOX5相互作用的蛋白。同时在敲低YAP1-A549细胞中过表达SOX5探究SOX5是否可拯救敲低YAP1所发挥的效应。 结果：1.通过GEO数据库分析发现高表达SOX5的NSCLC患者预后不良;qRT-PCR和Western blot中，SOX5均高表达于3种NSCLC细胞株而低表达于HBE，且相对于单层细胞，SOX5在肿瘤球里表达量更高。2.慢病毒感染A549和H1975细胞后，qRT-PCR和Western blot显示敲低SOX5后SOX5表达降低，而过表达SOX5后SOX5表达上调，成功构建SOX5敲低和过表达稳定细胞株。3.克隆形成实验和CCK-8实验显示：敲低SOX5后克隆形成体积变小，数量减少，细胞增殖活性减弱，过表达SOX5后克隆形成体积增大，数量增多，细胞增殖活性增强。4.成球试验显示：敲低SOX5后A549和H1975细胞形成的肿瘤球体积变小，数量减少，过表达SOX5后形成的肿瘤球体积增大，数量增多。5.Transwell细胞侵袭实验、划痕实验和免疫荧光伪足染色实验显示：敲低SOX5后A549和H1975细胞通过transwell小室侵袭细胞减少，伤口愈合率减慢，并减少了伪足的生成，过表达SOX5后通过transwell小室侵袭细胞增多，伤口愈合率加快，伪足生成增加。6.Western blot显示：敲低SOX5后干性标志物OCT4、NANOG、SOX2以及侵袭和迁移相关蛋白MMP2、VIMENTIN、SLUG的表达下调，过表达SOX5后这些蛋白的表达增加。7.体外实验显示敲低SOX5可减慢NSCLC细胞移植瘤生长速度和减小肿瘤体积，移植瘤免疫组化提示敲低SOX5后YAP1、SOX2和MMP2的表达减少。8.NSCLC细胞中敲低YAP1后，NSCLC细胞成球能力减弱，通过transwell小室的细胞减少，划痕愈合的速率减慢，细胞侵袭性伪足减少。Western blot显示：敲低YAP1后干性标志物OCT4、NANOG、SOX2以及侵袭和迁移相关蛋白MMP2、VIMENTIN、SLUG的表达下调。9.SOX5和YAP1均在肿瘤球里高表达，Western blot显示：YAP1的表达随着SOX5的改变而发生相应改变，而YAP1的下调也可引起SOX5的下调。10.Co-IP实验显示在NSCLC细胞中SOX5与YAP1形成复合物相互作用，免疫荧光实验显示SOX5与YAP1在细胞核共定位，核浆分离实验显示：过表达SOX5可增加YAP1进入细胞核，而在敲低YAP1-A549细胞中过表达SOX5可拯救敲低YAP1所致的相应效应。 结论：1.SOX5高表达于NSCLC细胞，并可促进肿瘤细胞增殖，自我更新，侵袭和迁移恶性行为。2.敲低YAP1可减弱NSCLC细胞自我更新，侵袭和迁移能力。3.SOX5可通过与YAP1相互作用发挥促癌作用。