目的:B类GPCR（G protein coupled receptor,GPCR）PAC1-R是神经肽垂体腺苷酸环化酶激活多肽（Pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide,PACAP）的偏好受体,其介导有效的神经保护活性。PAC1-R具有一个相对较大并且结构复杂的N-端胞外结构域（PAC1-EC1）,负责识别和结合配体。我们已有的研究显示具有显著体内外神经保护作用的强力霉素（Doxycycline,DOX）和米诺环素（Minocycline,MINO）可以作为PAC1-R的正向别构调节剂（Positive allosteric modulator,PAM）通过结合PAC1-EC1促进PAC1-R的正位激活（Yu R*,et al.Neuropharmacology.2015;103:1-15.）。基于以上研究基础,本研究拟通过计算机分子对接、微量热电泳（Microscale Thermophoresis,MST）、定点突变和cAMP检测等技术,分析和比较DOX/MINO及其衍生物,包括DOX不同修饰物、四环素（Tetracycline,TET）和替加环素（Tigecycline,TIGE）对PAC1-R的别构调节作用,试图详尽PAC1-R的N-端胞外结构域中正向别构调节剂结合位点的细节,为后续靶向PAC1-R的新型别构调节剂的筛选奠定基础。方法:利用Discovery Studio 2.5 Libdock获得DOX/MINO/TET/TIGE与PAC1-EC1的分子对接3D模型,并分析比较它们结合位点的信息;随后从分子水平利用MST分析技术测定DOX/MINO及其衍生物与PAC1-EC1结合的亲和力（平衡解离常数KD,解离百分比DP）;利用已建立的人为高表达PAC1-R偶联增强型绿色荧光蛋白（enhanced Green Fluorescence Protein,eGFP）的PAC1-CHO细胞系结合cAMP检测和MTT检测,从细胞水平检测DOX/MINO及其衍生物对PAC1-R正位激动剂PACAP（1-13）正位激活的别构调节作用;运用蛋白别构位点预测软件AlloSite对PAC1-R的N端胞外域进行别构调节位点预测;通过分析对比预测结果和分子对接结果中作用残基出现的频率,筛选出对PAM主要贡献的四个关键基序;最后通过定点突变获得与关键基序相应的PAC1-EC1四个突变体的重组蛋白,并结合MST检测实现对关键基序的鉴定。结果:MST结果发现三种不同化学修饰的DOX的KD值:C₂₂H₂₄N₂O₈.1/2C₂H₆O.HCL.1/2H₂O（6940+/-274μM）>C₂₂H₂₄N₂O₈（203.0+/-25.2μM）>C₂₂H₂₄N₂O₈.H₂O（148.0+/-4.28μM）,表明复杂的化学修饰会干扰DOX与PAC1-EC1的结合,其中没有任何修饰的DOX(C₂₂H₂₄N₂O₈)（203.0+/-25.2μM）和MINO(C₂₃H₂₇N₃O₇.HCL)（289.0+/-15.4μM）具有相似的结合性,TIGE(C₂₉H₃₉N₅O₈)（610.0+/-23.8μM）的结合能力最差;cAMP和MTT检测表明,DOX/MINO显著提高PACAP（1-13）对PAC1-R的激活,其EC₅₀值分别为11.2±1.7nM和7.1±1.1nM,是PAC1-R的高效PAMs,TET的EC₅₀为44.3±2.4nM,是PAC1-R的低效PAMs,TIGE的EC₅₀>1000nM,是PAC1-R的沉默别构调节剂;蛋白别构位点预测结果和分子对接结果筛选出构成小分子PAMs结合的四个关键基序;获得四个关键基序相对应的重组突变体,分别是:rPEM1:I26F27--A26A27,rPEM2:N60I61--A60A61,rPEM3:F110D111--A110A111,rPEM4:F115D116--A115A116;MST分析发现基序N60I61的突变完全干扰了小分子PAMs与PAC1-EC1的结合,是PAMs的关键组成;而基序F115D116一方面抑制了DOX的结合,另一方面促进了MINO的结合,表明基序F115D116在小分子PAMs与PAC1-EC1的结合中扮演复杂的边缘角色。结论:本研究首次在实验水平鉴定了DOX/MINO及其衍生物与PAC1-EC1的结合并具体测定亲和力;检测了DOX/MINO及其衍生物靶向PAC1-R的别构调节作用;验证了生物信息学预测的位于PAC1-R的N端胞外域中别构调节位点的存在;详尽了构成PAC1-R的N端胞外域的正向别构调节位点关键氨基酸的信息,为后续靶向PAC1-R的新型别构调节剂的筛选奠定基础。