研究背景肾细胞癌(renal cell carcinoma, RCC)简称肾癌,是成人肾脏肿瘤中最常见的类型,约占所有肿瘤的2～3%。透明细胞癌(clear cell RCC, ccRCC)是RCC中最常见的肿瘤类型,约占肾癌总数的70～80%。近年来,随着人均寿命的提高和健康查体的普及,其发病率呈增加趋势,严重威胁着人类的健康。部分或根治性肾切除(开放性或腹腔镜手术)是治疗局限性肾癌的最佳方案,其五年生存率可以达到～85%；由于肾癌对放射治疗和化学治疗不敏感,进展性(包括转移、复发)肾癌的五年生存率仅为～10%,而这部分患者约占肾癌患者总数的50%。到目前为止,还没有一种公认的肾癌筛选、诊断、治疗分层和检测疗效的分子标志物出现,因而,寻找并挖掘更多的肾癌早期诊断、预后评估、治疗分层、复发监测的分子靶点成为一个重要的临床课题。以质谱为基础的蛋白质组学正逐渐成为鉴定、定量和描述总体蛋白质特征的一种常用工具,特别是在复杂的肿瘤生物样品中寻找或发现潜在的肿瘤分子标记物和细胞信号通路方面,应用前景广阔。建立在鉴定相同肽段的离子强度或同一蛋白的谱图数目基础上的非标记定量蛋白质组学研究,已逐渐成为比较复杂生物样品中大量蛋白质的一种广受欢迎的方法。蛋白质翻译后修饰(posttranslational modification, PTM)对细胞的活性、稳定性、细胞内定位和更新产生显著的影响,已知磷酸化、糖基化、乙酰化和硝基化等修饰与肿瘤的发生有关。由于蛋白质赖氨酸位点的乙酰化中和蛋白质所带的正电荷,因而这种可逆的修饰通常调节蛋白质(尤其是组蛋白)的稳定性和蛋白-蛋白之间的相互作用。最近,越来越多的证据证明非组蛋白的乙酰化和蛋白质的功能改变密切相关。在肾癌研究方面,蛋白质组学已被用来鉴定肿瘤和癌旁正常组织的差异表达蛋白,例如60kD热休克蛋白(heat shock protein, HSPD1)、过氧化物酶(catalase, CAT)、烯醇化酶(alphaenolase, ENO1),这些蛋白可能成为肾癌潜在的诊断、预后分子标记物和治疗靶点,但是关于肾癌蛋白的翻译后修饰鲜有报道。近来的研究也报道了一些肾癌组织或细胞系的细胞信号通路,例如线粒体失功能、糖酵解、细胞代谢和蛋白质转运,但没有一篇文献涉及翻译后修饰。由于赖氨酸乙酰化是一种生物体内广泛存在的修饰,我们推测蛋白质的乙酰化可能参与了肾癌的发生、发展过程。研究目的我们在前期研究中发现,一种新的有丝分裂驱动蛋白Eg5靶向药物,S(MeO)TLC,在肾细胞癌裸鼠模型体内和细胞系试验中都显示了强大的抗肿瘤活性。为了找到更多的治疗靶点和诊断、预后的分子标记物,我们应用非标记定量蛋白质组学方法比较ccRCC和癌旁肾组织中差异表达蛋白质谱和探讨肿瘤相关的细胞信号通路,然后选择两个蛋白,乙酰辅酶A乙酰基转移酶1 (acetyl-CoA acetyltransferase 1, ACAT1)和锰型超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase, MnSOD),来印证它们在ccRCC中的表达和调节。以上这些结果能够帮助找到肾癌潜在的诊断或预后分子标记物和新的治疗靶点。同时,我们观察到MnSOD蛋白的乙酰化在ccRCC和癌旁肾组织存在差异,在找到MnSOD去乙酰化酶Sirt3的基础上,我们观察Sirt3去乙酰化MnSOD后对MnSOD酶活性或肾透明细胞癌细胞系786-O细胞功能的影响。方法1)肾透明细胞癌(ccRCC)和癌旁肾组织的定量蛋白质组学分析。我们选用12对ccRCC和癌旁肾组织的组织裂解液分别构建1对混合样品总蛋白,分别通过胶内酶解和溶液内酶解方法处理这对混合样品总蛋白,然后采用高压液相色谱-串联质谱(high pressure liquid chromatography-tandem mass spectrometry, HPLC-MS/MS)和非标记定量蛋白质组学(总离子强度和谱图计数法)方法来鉴定和比较这些表达失调的蛋白。2)多种细胞信号通路分析工具,包括信号网络分析(Ingenuity Pathway Analysis,IPA)、基因相互作用检索的搜索工具(Search Tool for the Retrieval of Interacting Gene, STRING)和数据库的注释、可视化和整合发现(Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery, DAVID),探讨这些表达失调蛋白中与肿瘤相关的信号通路和生物过程。3)蛋白印迹和免疫组织化学方法印证两种失调蛋白,MnSOD和ACAT1在另6对ccRCC和癌旁肾组织中的表达。4)非标记定量蛋白质组学比较失调蛋白的乙酰化修饰。质谱仪鉴定MnSOD和ACAT1的乙酰化修饰位点,并用非标记定量蛋白质组学比较MnSOD这一失调蛋白的乙酰化修饰。5)构建质粒5’Flag-pcDNA3.0-sod2 (Sod2),转染786-O细胞。PCR鉴定、质粒DNA酶切鉴定和DNA测序印证质粒Sod2构建成功；质粒Sod2、空白载体(empty vecor,EV)和三种去乙酰化酶Sirt2、Sirt3、Sirt6分别转染786-O细胞。6)蛋白印迹和免疫沉淀探讨去乙酰化酶Sirts对肾透明细胞癌细胞系786-O中MnSOD乙酰化的影响。MnSOD、乙酰化(Pan-AC)抗体检测内源性、外源性MnSOD的乙酰化水平。7)SOD酶活性试剂盒测定MnSOD酶活性。786-0细胞转染EV和三种去乙酰化酶Sirt2、Sirt3、Sirt6,收集细胞、匀浆后测定细胞中MnSOD的酶活性。8)786-0细胞增殖、凋亡能力测定。786-O细胞转染EV和三种去乙酰化酶Sirt2、 Sirt3、Sirt6,分别用MTT测定786-0细胞的增殖水平、Hoechst荧光染料测定786-0细胞的凋亡水平。结果1)溶液内酶解方法在ccRCC和癌旁组织中分别鉴定到了1872和1927个蛋白质,其中,Progenesis LC-MS软件定量到了1037个蛋白,表达失调的蛋白有213个。胶内酶解方法在ccRCC和癌旁组织中分别鉴定到了5816和5571个蛋白质(这是目前已知肾细胞癌中鉴定到最多的蛋白数目),谱图计数定量到了3381个蛋白,表达失调的蛋白有208个。2)多种细胞信号网络分析工具,包括IPA、STRING和DAVID,在表达失调蛋白中找到了多个肿瘤相关的信号通路和生物过程,比如线粒体失功能、代谢途径、细胞死亡和乙酰化修饰。3)蛋白质印迹和免疫沉淀印证两个线粒体失调蛋白,MnSOD和ACAT1,在另6对ccRCC和癌旁肾组织中的表达失调：MnSOD在ccRCC中表达增高而ACAT1在ccRCC中表达降低。4)质谱显示,ACAT1在赖氨酸174位、MnSOD在赖氨酸68和130位都存在乙酰化修饰,这是第一次在肾细胞癌中鉴定到这两个蛋白的乙酰化；而且,MnSOD赖氨酸68、130位乙酰化在ccRCC中随着MnSOD表达的增加而增加。5)我们成功构建了MnSOD蛋白表达的质粒Sod2、找到了MnSOD去乙酰化酶Sirt3,肾透明细胞癌细胞系786-0内源性MnSOD有乙酰化修饰,而瞬时转染的外源性MnSOD没有检测到乙酰化修饰。6)去乙酰化酶Sirt3使786-0细胞线粒体蛋白MnSOD乙酰化程度降低,进而增强MnSOD的酶活性、增加细胞的增殖能力,而对细胞凋亡没有影响。结论1)以质谱为基础的非标记定量蛋白质组学在ccRCC和癌旁肾组织样品中鉴定到了上千种蛋白质、确定了200余个表达失调蛋白,这些差异表达蛋白或失调蛋白参与了肾细胞癌的生成,也有潜力成为肾透明细胞癌的诊断、预后标记物和分层治疗的靶点；2)通过多种细胞信号通路分析工具,包括IPA、STRING和DAVID,我们也发现了很多在肾透明细胞癌中被激活的细胞信号通路和生物过程,像线粒体失功能、赖氨酸乙酰化,有可能成为肾透明细胞癌新的治疗靶点,从而大大提高肿瘤患者的预后、增加总体生存率,特别是那些不能手术的肾细胞癌患者；3) MnSOD在ccRCC和癌旁组织中的表达和乙酰化修饰均存在差别,MnSOD乙酰化影响肾透明细胞癌细胞系786-0的增殖能力,提示它参与了肾透明细胞癌的发生过程,靶向MnSOD蛋白及其乙酰化位点,有可能成为治疗肾细胞癌的一个新选择。创新点1)通过胶内酶解方法,我们在ccRCC和癌旁组织中分别鉴定到了5816和5571个蛋白质,这是目前已知肾细胞癌中鉴定到最多的蛋白数目；2)这是第一次报道并定量ccRCC中MnSOD的乙酰化；3)这是第一次报道MnSOD上赖氨酸乙酰化影响肾透明细胞癌细胞系786-0的功能(MnSOD酶活性、细胞增殖)。