研究背景及意义对于恶性肿瘤发生的确切机制,到目前为止尚不完全明确,但已知是由一系列具有内在联系的多个步骤组成的、肿瘤细胞与宿主细胞和周围微环境之间相互作用的、连续的、多阶段的、极其复杂的动态过程,随着细胞外基质异常沉积促进实体肿瘤的发生、发展以及肿瘤及其微环境生物力学特性逐步被认识,在二维(2 dimensional,2D)和三维(3 dimensional,3D)环境中考察细胞外基质力学对肿瘤细胞生物学行为影响的研究越来越多。其结果表明细胞外基质力学不仅影响肿瘤细胞的形态、增殖、迁移、侵袭,还影响到了肿瘤干细胞的特性和肿瘤细胞的耐药性等。细胞是生物体的基本组成单位。几乎所有的哺乳类动物细胞之间存在成分复杂的细胞外基质(extracellular matrix ECM),细胞外基质(ECM)是由细胞合成并分泌到胞外、分布于细胞表面或细胞之间的大分子,组成的一个复杂的大分子网络,主要是一些多糖、蛋白或蛋白聚糖,它不属于任何细胞,是动物组织的一部分。这些物质构成复杂的网架结构决定了结缔组织的特性,使其具有独特的物理、生物化学和生物力学特性。ECM不仅本身可作为细胞膜上受体的配体,还能影响细胞因子的扩散和可接触性,进而调节细胞对微环境的感受和相互作用,使得各种信号级联反应由细胞膜传递到细胞核。ECM的物理性质包括基质刚度、孔隙率、不可溶解性、空间排布和取向(拓扑结构)以及其他特性。这些特性共同决定了其维持组织结构完整的功能特性,并直接影响细胞的行为及其对微环境的响应。细胞外基质具有连接、支持、保水、抗压及保护等物理学作用。正常真核细胞,除成熟血细胞外,大多须粘附于特定的细胞外基质上才能抑制凋亡而存活,称为定着依赖性(anchorage dependence)。例如,上皮细胞及内皮细胞一旦脱离了细胞外基质则会发生程序性死亡。细胞只有黏附于一定的基质才能进行蛋白和RNA的合成,只有在铺展状态下才能进行DNA的复制。细胞外基质可通过结合生长因子来增强或抑制其活性。不同的细胞外基质对细胞增殖的影响不同。例如,成纤维细胞在纤粘连蛋白基质上增殖加快,在层粘连蛋白基质上增殖减慢；而上皮细胞对纤粘连蛋白及层粘连蛋白的增殖反应则相反。肿瘤细胞的增殖丧失了定着依赖性,可在半悬浮状态增殖。体外实验证明,各种细胞脱离了细胞外基质呈单个游离状态时多呈球形。同一种细胞在不同的细胞外基质上粘附时可表现出完全不同的形状。上皮细胞粘附于基膜上才能显现出其极性。细胞外基质决定细胞的形状这一作用是通过其受体影响细胞骨架的组装而实现的。不同细胞具有不同的细胞外基质,介导的细胞骨架组装的状况不同,从而表现出不同的形状。细胞通过与特定的细胞外基质成分作用而发生分化。例如,成肌细胞在纤粘连蛋白上增殖并保持未分化的表型；而在层粘连蛋白上则停止增殖,进行分化,融合为肌管。细胞外基质可以控制细胞迁移的速度与方向,并为细胞迁移提供“脚手架”例如,纤粘连蛋白可促进成纤维细胞及角膜上皮细胞的迁移；层粘连蛋白可促进多种肿瘤细胞的迁移。细胞的趋化性与趋触性迁移皆依赖于细胞外基质。这在胚胎发育及创伤愈合中具有重要意义。细胞的迁移依赖于细胞的粘附与细胞骨架的组装。细胞粘附于一定的细胞外基质时诱导粘着斑的形成,粘着斑是联系细胞外基质与细胞骨架“铆钉”。ECM成分的产生、交联、降解和重建是一个动态过程,异常的ECM代谢常常伴随着疾病的发生,越来越多的实验研究表明：在实体恶性肿瘤的发生和发展过程中往往伴随着ECM的异常沉积、细胞表面受体表达的变化及组织刚度的增加。利用影像学技术手段检测组织密度或刚度对早期检查和诊断肿瘤有着重要的临床意义。异常的ECM一方面直接促进细胞的恶性转化和转移,另一方面通过影响微环境中的间质细胞,促进肿瘤相关的血管生成和炎症发生,形成成瘤微环境。正确认识肿瘤细胞和微环境的力学特征对于研究细胞外基质力学对肿瘤的发生、发展及其生物学行为的影响具有极其重要的意义。随着细胞外基质异常沉积促进实体肿瘤的发生、发展以及肿瘤及其微环境力学特性逐步被认识,研究细胞外基质力学对肿瘤细胞生物学行为影响的报道越来越多。肿瘤细胞外间质组织的硬化不仅促进了肿瘤发生与发展的进程,还增加了其耐药性。细胞外基质异常沉积引起的药物耐受归于以下两个主要方面原因：(1)降低或抑制药物的效用(例如限制药物的扩散和进出细胞的速率)。药物在具有丰富胶原网络的肿瘤组织中渗透比低密度胶原的组织低。(2)提高肿瘤细胞对药物损伤的耐受性(例如降低凋亡敏感性)。细胞外基质介导的整合素信号能抑制化疗药物诱导的凋亡过程。研究报道,相较于软基底(1kPa),硬基底(12kPa)能抑制顺铂诱导的非小细胞肺癌细胞的凋亡,经药物作用后在软基底上存活下来的癌细胞的致瘤性比硬基底上存活的癌细胞要强。但是,非小细胞肺癌细胞在极硬(约106 kPa)的基底上对顺铂药物的敏感性是在5kPa基底上的2倍,这提示在筛选抗癌药物的时候,考察符合生理病理的细胞外基质力学因素是不容忽视的。Hippo-YAP信号转导通路是最近几年新发现的一个信号转导通路。研究证明Hippo-YAP信号通路是参与调控器官发育大小的关键信号通路,这一观点首先在果蝇中被发现,Hippo-YAP信号通路属于抑制生长性信号通路,在进化过程中非常保守,多细胞动物果蝇、小鼠、哺乳动物中都存在Hippo-YAP信号通路。在果蝇中发现的Hippo-YAP信号传导通路是调节细胞大小、器官体积的主要信号通路,果蝇中的Hippo-YAP信号通路的成员都能在高等生物中找到对应的同源物。Hippo-YAP信号转导通路通过促进细胞调亡和限制细胞增殖的途径来调控器官大小的发育,越来越多的证据表明Hippo-YAP信号转导通路的调控可能与人类的肿瘤发生、发展密切相关。人体内的各种生理反应都是由相应的蛋白参与和调节的,而这些蛋白的表达水平和活性程度同时也受多水平、多方面的调节。蛋白的磷酸化和去磷酸化是蛋白活性调节的一种重要的形式,通过磷酸化或去磷酸化,改变了蛋白的生物学活性。目前蛋白的磷酸化研究已经成为基因表达、蛋白组学、酶动力学研究中的一个重要方面。在生理状况下,存在着大量非细胞核的蛋白被磷酸化修饰。在哺乳类动物中,Hippo-YAP信号通路上游的膜蛋白受体感受到胞外的生长抑制信号后,经过一系列激酶复合物的磷酸化级联反应,最终将磷酸化下游的效应因子YAP。磷酸化的YAP与细胞骨架蛋白相互作用,被滞留在胞质内,不能进入细胞核行使其转录激活功能。YAP做为Hippo-YAP信号通路的下游效应因子具有转录激活功能,通过与细胞核内转录调节因子(TEAD)结合,促进下游目的基因的表达,从而促进细胞生长,抑制细胞凋亡的基因转录,如survivin、cyclinE等,并受其它几个基因的调控,如：Mst1/2、WW45、Lats1/2和Mob,这些调控途径上游基因中的任何一个发生变异或者YAP基因的过量表达都将会引起细胞的过量生长。在哺乳类动物细胞中,Hippo-YAP信号通路通过磷酸化和促进细胞质转位来抑制YAP及其同系物TAZ的功能。TEAD家族转录因子是进化上保守的影响YAP生物功能的关键因子。YAP是一个候选的致癌基因,而Hippo-YAP信号通路上的其他几个因子是肿瘤抑制因子。如果Hippo-YAP信号通路功能失调将导致癌细胞丧失接触性抑制(癌细胞不受接触性抑制局限将更容易扩散,肿瘤灶将更快地扩散)。有研究表明,YAP基因是一个潜在致癌基因。一方面,YAP能够与细胞核内转录增强因子TEAD结合,促进肿瘤细胞DNA的转录,产生肿瘤细胞的促增殖作用；另一方面,YAP又能够诱导Survivin等凋亡抑制因子转录的增加,从而发挥肿瘤细胞的凋亡抑制作用。YAP作为Hippo-YAP信号通路下游核心作用因子在哺乳类动物中高度保守,YAP在发挥生物学作用过程中,不可能负责整个过程的每一步,它可以提供有利于细胞增殖和抑制细胞凋亡的微环境,增加细胞恶性转化前细胞相关基因组的不稳定性,提高下游目的基因的表达水平,增强细胞恶性转变的能力,YAP在细胞生长,分化,凋亡过程中发挥的作用,表明它在维持组织器官的稳定性中发挥的作用,如果YAP一旦功能失调,便有利于正常细胞向恶性肿瘤细胞转化。非小细胞肺癌的发生、发展、侵袭和转移均依赖于细胞外基质沉积和交联,间质刚度增加,同时肿瘤细胞软化,最终形成异质性的肿瘤力学微环境。基质力学通过影响肿瘤细胞的增殖、迁移、转移、EMT、肿瘤干细胞特性以及耐药性等调控肿瘤的发生和转移,然而,YAP与细胞外基质力学对非小细胞肺癌生长的研究,目前国内外尚未见相关的报道。本研究将针对YAP通过细胞外基质力学调节非小细胞肺癌细胞的生长进行研究。目的：采用不同硬度的培养基质与RNA干扰技术特异性抑制非小细胞肺癌细胞内YAP蛋白的表达,探讨YAP蛋白与细胞外基质力学调节非小细胞肺癌的生长的机制。方法：通过调整丙烯酰胺和双丙烯酰胺交联剂的用量,生成不同硬度的培养基质,采用细胞免疫荧光技术和western blot检测不同硬度培养基质的非小细胞肺癌细胞株SPCA-1中YAP在细胞内的定位和蛋白的表达水平,以脂质体2000作为转染试剂,将特异性沉默YAP基因的siRNA转染在不同硬度培养基质中的细胞株内,western blot检测干扰效果,以及实时荧光定量PCR、western blot检测CTGF、 AREG、Survivin、Ki67在mRNA水平和蛋白水平上的表达变化。结果：通过调整丙烯酰胺和双丙烯酰胺交联剂的用量,生成不同硬度的fibronectin-coated PA凝胶。在40kPa基板上培养的细胞中,YAP主要定位于细胞核。在4kPa基板上培养的细胞中,YAP主要定位于细胞质中,细胞核中的YAP相对于40kPa基板上培养的细胞明显低表达,YAP蛋白的表达在硬基质上培养后非常显著增加(P<0.001)。而p-YAP和LATS1蛋白的表达在硬基质上培养后明显减少。合成的siYAP能显著抑制SPCA-1细胞中YAP蛋白的表达,在40kPa基板上培养的细胞在YAP基因沉默后,细胞增殖率显著降低,两组间差异具有统计学意义(P<0.05)。在4kPa基板上培养的细胞在YAP基因沉默后,细胞增殖率无显著差异。此外正常表达YAP的SPCA-1细胞中,在4kPa基板上培养的细胞增殖率相对于在40kPa基板上培养的细胞增殖率显著降低,两组间差异具有统计学意义(P<0.05)。在40kPa基板上培养的细胞中,YAP基因沉默后,CTGF、 AREG、Survivin及Ki67的mRNA及蛋白表达水平显著降低,两组间差异具有统计学意义(P<0.05),在4kPa基板上培养的细胞中,YAP基因沉默后,CTGF、 AREG、Survivin及Ki67的mRNA及蛋白的表达水平无明显降低。正常表达YAP的SPCA-1细胞中,在4kPa基板上培养的细胞相对于在40kPa基板上培养的细胞,CTGF、AREG、Survivin及Ki67的mRNA及蛋白表达水平均显著降低,两组间差异具有统计学意义(P<0.05)。结论：细胞外基质的硬度影响了非小细胞肺癌细胞的生物学行为,YAP通过细胞外基质力学调节非小细胞肺癌的生长,揭示Hippo-YAP信号通路通过特定的微环境调节非小细胞肺癌的生长。