论文部分内容阅读
研究目的:本研究通过二代高通量测序(Next-generation sequencing,NGS)技术,对桥本甲状腺炎(Hashimoto’s thyroiditis,HT)患者及健康志愿者外周血中长链非编码RNA(Long non-coding RNA,LncRNA)表达谱的特征进行分析;筛选并验证了显著差异表达的LncRNAs,分析其与患者自身抗体水平的关系进而探讨其诊断价值;运用生物信息学技术对差异表达的LncRNAs进行功能分析,探究其可能参与的生物学过程并预测潜在的调节基因;对调节基因的表达水平进行检测并分析其与LncRNAs的关系,初步探究LncRNAs在HT发病过程中的生物学作用,为LncRNAs参与HT的发病机制提供新的研究方向。研究方法:1、选取5例初发的HT患者及5例健康志愿者分别归为实验组和健康对照组,运用Trizol法提取外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)中总RNA,RNA质控合格后构建测序文库,随后将10 pM文库变性为单链DNA分子,扩增后在Illumina HiSeq 4000测序仪上采用双端模式(PE mode)进行测序;利用生物学及相关统计学软件进行分析,得到HT患者与健康对照组之间LncRNAs的表达谱。2、收集30例临床确诊的HT患者及30例健康志愿者的外周血标本,选取表达谱中HT患者组与健康对照组中显著差异表达(Fold change≥2.0,P≤0.05)的六个LncRNAs,运用实时荧光定量PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)技术进行检测;选取与测序结果差异表达一致的LncRNAs,分析其与HT患者自身抗体的相关性,运用ROC曲线分析其对疾病的诊断价值。3、运用生物信息学方法对差异表达的LncRNAs的潜在靶基因进行基因本体论(Gene Ontology,GO)功能分析和KEGG Pathways分析,以推测并注释这些基因可能参与的信号通路,预测其生物学功能。4、通过检索文献,选取被验证的LncRNAs与HT可能存在相关性的四个潜在靶基因,运用PCR技术检测其在HT中的表达变化,分析其与LncRNAs表达变化的相关性。研究结果:1、运用高通量测序技术,在HT患者组与健康对照组之间检测到的共同的LncRNAs中,69544个上调,27742个下调;其中,218个显著差异表达的LncRNAs中,94个上调,124个下调(Fold-change≥2.0,P-value≤0.05)。2、对218个显著差异表达的LncRNAs进行分析,根据其在测序样本间的平均分布程度、P值大小、差异变化倍数、分子量大小等因素,选取六个LncRNAs,运用PCR检测其表达,结果显示:LncRNA-XLOCl2006631和LncRNA-LOC729737表达上调,LncRNA-LOC100288778和LncRNA-BC041964表达下调,与测序结果一致;相关性分析显示,这四个LncRNAs均与甲状腺自身抗体存在相关性,提示这四个LncRNAs可能参与了HT的发生及发展;ROC曲线分析结果提示,Lnc-XLOCl2006631,Lnc-LOC729737,Lnc-LOC100288778及Lnc-BC041964的AUC面积均在0.5-1.0之间,且P<0.05,即这四个LncRNAs均具有一定的诊断价值,其中Lnc-XLOCl2006631 (AUC:0.926,95%CI 0.855-0.997,P<0.001)诊断价值最高。3、采用生物信息学功能预测的方法,对高通量测序结果的差异表达的LncRNAs潜在靶基因进行GO分析,结果显示,在生物学过程、细胞组分及分子功能方面富集程度最高的三项,在上调的LncRNAs潜在靶基因中分别为“membrane assembly”、“proton-transporting two-sector ATPase complex,catalytic domain ”和“proton-transporting ATP synthase activity,rotational mechanism”;在下调的LncRNAs潜在靶基因中分别为“embryonic viscerocranium morphogenesis”、“transcription export complex”和“acetylcholine binding”。对高通量测序结果中差异表达的LncRNAs进行KEGG Pathways分析,结果显示,与差异表达上调、下调的LncRNAs潜在靶基因相关的信号通路分别有17条、19条。4、运用荧光定量PCR技术对经过验证的四个LncRNAs的潜在靶基因进行检测,结果显示,RUNX3、STAT3的mRNA表达下调,IL-21R、MECP2的mRNA表达上调;相关性分析显示,Lnc-LOC729737与MECP2的mRNA表达呈正相关,Lnc-LOC100288778与RUNX3的mRNA表达呈正相关,Lnc-BC041964与IL-21R的mRNA表达呈负相关,Lnc-XLOCl2006631与STAT3的mRNA表达呈负相关。结论:1、该研究运用二代高通量测序的方法,筛选并构建了HT患者与健康对照组之间差异表达的LncRNAs的表达谱。2、显著差异表达的LncRNAs的验证结果显示,Lnc-LOC729737、Lnc-LOC100288778、Lnc-BC041964及Lnc-XLOCl2006631的表达变化与高通量测序一致;相关性分析显示,这四个LncRNAs与甲状腺自身抗体均存在相关性,提示其可能参与了HT的发生发展过程;ROC曲线分析提示上述四个LncRNAs均具有一定的诊断价值,其中Lnc-XLOCl2006631对于疾病诊断价值最高。3、生物信息学方法预测及分析显示,LncRNAs参与了如甲状腺激素信号通路等与HT相关的多种生物学过程。4、Lnc-LOC729737、Lnc-LOC100288778、Lnc-BC041964及Lnc-XLOCl2006631的潜在靶基因MECP2、RUNX3、IL-21R及STAT3在HT患者体内表达异常且二者存在相关性,提示这四个LncRNAs可能参与HT的发病机制,为后续功能实验提供研究基础。