原发性肝癌在全世界每年的新发病例大约为70万例,目前已经成为一种严重影响生命健康的恶性肿瘤。原发性肝癌主要包括肝细胞性肝癌、胆管细胞癌、肝母细胞瘤和肝血管肉瘤。其中,肝细胞肝癌所占的比例最高,占原发性肝癌的80%以上。在亚洲特别是中国的肝癌发病率明显高于世界平均水平,有报道指出,全世界的肝癌患者50%以上集中在中国。肝细胞性肝癌发病的主要危险因素有:肝炎病毒感染(在我国主要为乙型肝炎病毒感染)、大量饮酒、长期摄入黄曲霉素污染的食物、肥胖、吸烟、脂肪肝、糖尿病等等。在不同的国家和地区,肝细胞肝癌的主要危险因素往往不尽相同,以上种种均对肝癌的临床诊断、治疗以及患者的预后造成影响。据文献报道,目前我国肝细胞肝癌的死亡率已经占到我国所有癌症的18.8%。到目前为止,肝癌的标准治疗措施仍然是以手术为主的综合治疗,且手术切除被认为是早期肝癌患者的首选的且最有效的治疗措施,术后患者的5年生存率可以达到60%-70%,有些患者甚至可以达到根治的效果。随着术前影像学及实验室检查技术的进步,肝癌患者的术前评估如child-pugh肝功能评级、吲哚菁绿清除实验(ICG15)及肝静脉压力梯度等检测更加完善。随着医疗技术及医疗器械的创新及进步,如超声刀、氩气刀、区域肝血流阻断等技术的不断发展,对肝脏本身解剖结构的重新认识和临床医生手术水平的提高,肝癌患者的围手术期死亡率明显下降,一些大的医疗中心可以将死亡率控制在1%-5%。然而,肝癌患者的长期预后仍然达不到满意的效果。导致肝细胞肝癌预后不良的因素有很多:早期没有明确的临床症状,发生临床症状就医时往往已发展到进展期、对放化疗等肿瘤治疗手段不敏感、肿瘤手术切除后复发率高及往往较早出现的多部位、多器官转移等等。在这些原因当中,肝癌手术过程中原发灶的残留及转移灶未得到足够的清除是肝癌切除术后复发的最常见原因。肝癌的术后复发已经严重影响到肝癌患者的治疗效果及预后。然而,目前对这两方面的判断往往需要肿瘤达到一定体积且周边组织出现明显的转移灶后才能得到明确的判断,且这种判断往往需要根据临床医生的经验来完成。怎样找到一种能够让临床医生更直观、准确的判定肿瘤存在及手术切除范围的方法,是广大科研人员及临床工作者的迫切需求,也是本实验想解决的问题。随着人们对荧光现象的不断认识及各种特异性荧光染料的不断发展,荧光识别检测技术在生命科学研究领域中的应用日益广泛。对生物体内某些细胞或是细胞器所存在或表达的某些特异性指标进行识别,并将这些生物体内的微观信号通过某种手段转化成可被仪器或人所直接识别的宏观信号的方法及过程称为生物识别。可以用于生物识别的一类与细胞生长、分化、增值、变性、凋亡的一类特征性生物产物被称为生物标志物。在生物学的研究领域上,生物标志物被广泛应用于细胞学、肿瘤学、生物代谢等相关领域。因其生理特性和其微观性的表现方式,生物标志物具有高准确性及高敏感性的特点,可以在生物学行为改变的早期,未表现出明显宏观变化时对这种改变做出反应。通过某些特殊的设备和技术,可以将生物标志物发生的微观变化形成可被观测到的现象,从而达到对生物分子的识别,特异性疾病的诊断以及针对某些靶相位点进行生物学治疗的目的。其中,生物识别技术与荧光显色技术相结合既构成荧光探针技术。荧光探针(fluorescenceprobe)指在紫外-可见-近红外区有特征荧光,并且其荧光性质(激发和发射波长、强度、寿命、偏振等)可随所处环境的性质,如极性、折射率、粘度等改变而灵敏地改变的一类荧光性分子。目前,在生物研究中,常利用荧光探针与核酸(dna/rna)、蛋白质或其他大分子结构发生非共价相互作用,使其荧光性质发生改变,发出特异性荧光,通过检测这些荧光信号,达到检测生物体中某种物质变化的目的。cox-2是环氧合酶的诱发性亚形,在正常组织中很少表达或不表达,在受到炎症、肿瘤等外界刺激时发生高表达。目前,已发现cox-2在胃癌、肝癌、乳腺癌、结肠癌等多种肿瘤中表达升高,并有多项研究证明cox-2与多种肿瘤的发生、发展、转移等生物学行为均具有密切的关系。因为cox-2的这一特点,我们考虑将其作为肿瘤的生物标志物用于肿瘤的检测与识别。本实验应用荧光探针标记肝脏肿瘤组织中高表达而在正常肝组织中不表达的生物标记物cox-2,使其发出可见光波长范围内并可被仪器及肉眼识别的荧光,达到鉴别肿瘤的目的。从而为肝细胞肝癌的生物学研究、实验诊断、术中肝癌原发灶的判定及转移灶的鉴别提供一种新的思路与方法。目的:合成可以靶向到COX-2的荧光探针并应用其对肝癌细胞、组织和动物模型进行荧光染色,探讨其在临床上的应用价值。方法:1.应用荧光基团和COX-2识别基团合成荧光探针。2.对荧光探针X进行了光稳定性、COX-2识别特异性等性质的测定。3.应用western blot技术验证人肝癌细胞SMMC7721、BEL7402及正常肝细胞LO2中的COX-2蛋白表达情况。4.应用荧光探针X对上述细胞进行荧光染色。5.验证了荧光探针是通过靶向到COX-2蛋白后形成的肿瘤细胞荧光显色。6.验证了荧光探针的细胞毒性。7.制作了裸鼠人肝癌细胞皮下转移瘤模型并对其进行了活体荧光染色。8.对手术切除的人肝癌组织和正常肝组织进行了对比荧光染色。结果:1.合成的荧光探针X能通过结合COX-2蛋白产生荧光,光学稳定性良好。2.人肝癌细胞SMMC7721、BEL7402可被荧光探针X进行荧光显色,且western blot技术证实其高表达COX-2。3.荧光探针可以实现对肝癌细胞及正常肝细胞的荧光区分。4.荧光探针对肝癌细胞及正常肝细胞的荧光区分是通过特异性结合COX-2实现的。5.荧光探针在细胞学实验中未见明显细胞毒性。6.荧光探针可对裸鼠的人肝癌皮下转移瘤形成荧光染色。7.荧光探针能够对手术切除的肝癌组织和正常肝组织进行荧光区分。结论:合成的荧光探针X可以通过靶向到COX-2蛋白从而对肝癌细胞、肝癌组织及裸鼠人肝癌细胞皮下转移瘤产生荧光现象并能与正常肝细胞和组织区分,有进一步探讨其临床应用价值的可能。