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马链球菌兽疫亚种和猪链球菌2型是我国猪链球菌病的两种主要病原。马链球菌兽疫亚种主要引起猪的化脓性关节炎和败血症，而猪链球菌2型不仅可引起猪脑膜炎、关节炎、心内膜炎、败血症、肺炎和突然死亡，还可以感染相关人员并致死，是一种重要的人畜共患病病原。所以猪链球菌2型在世界很多国家均受到重视，对它的研究主要集中在与毒力相关蛋白的研究上。猪链球菌2型主要的致病因子有荚膜、溶血素、溶菌酶释放蛋白(muraminidase-released protein，MRP)和胞外蛋白因子(extracellular protein factor，EF)等．根据MRP和EF等毒力相关蛋白的存在与否，猪链球菌2型可分为以下几种表现型：MRP~+EF~+、MRP~-EF~-、MRP~+EF~*、MRP~*EF~-、MRP~-EF~+、MRP~+EF~-、MRP~-EF~*等。对我国江苏地区的流行病学调查显示，来自疫区的2型菌株均为对猪有强毒力的MRP~+EF~+表现型。所以检测MRP、EF的有无和进一步的研究MRP、EF的致病机理，对猪链球菌2型引起的链球菌病的诊断，防治和根除具有很重要的意义。本实验的主要目的就是检测MRP和EF，分别建立多重PCR和制备MRP和EF的单抗。最后结合我国猪链球菌病的实际情况，设计了两重PCR，同时检测马链球菌兽疫亚种和猪链球菌2型。 首先结合我国实际，马链球菌兽疫亚种和猪链球菌2型是猪链球菌病的主要病原。本实验在在鉴定猪链球菌2型的基础上，根据马链球菌兽疫亚种的一种重要的型特异性抗原一类M蛋白，设计一对特异性引物，建立了分群PCR。PCR结果显示它能快速的从混合培养物和混合感染的病料中鉴别出这两种病原，所以此方法可以用于猪链球菌病的实验室诊断和流行病学调查。 其次研制鉴定致病性猪链球菌2型的多重PCR试剂盒。猪链球菌2型中存在强毒力、弱毒力和无毒力等菌株，而且在我国，两种毒力因子MRP和EF与强毒力具有相关性。所以检测MRP和EF的有无，可以鉴定猪链球菌2型的强弱。本实验在2型分型PCR的基础上，分别设计MRP和EF的引物，通过优化PCR反应条件和体系，建立了一个多重PCR检测试剂盒，它能在鉴定2型的基础上，检测MRP、EF以及EF~*，鉴定毒力的强弱。与细菌分离方法相比，它检测时间短，方便易行，而且敏感高，特异性好，为猪链球菌2型的流行病学调查提供了一个很好的方法。 最后，在鉴定为强毒力的菌株中，研究其毒力因子的功能，为此，本实验首先制全文摘要备了MRP和EF的单杭.通过优化培养基和硫酸氮分级沉淀等方法纯化EF;利用阴离子交换层析和凝胶层析等方法纯化MRP，分别制备M即和EF杭原，免疫BALB/c小鼠，细胞融合后，筛选阳性杭体的细胞克隆，多次有限稀释得到杭MRP和EF的单克隆细胞株，免疫印迹鉴定后，分别制备腹水杭体.并对MRP的一株单杭初步应用，将腹水单杭初步纯化后，用FITC进行标记，建立直接荧光法，检测和区分MR卫+株和MRP一株.