【摘 要】
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研究表明抗菌肽Antibacterial peptide（AMP）种类繁多、且来源广泛,普遍存在于自然界中,AMP具有广谱抑菌活性及较高的杀菌能力。其分子量小、容易被代谢,抑菌作用快而不易产生耐药性,结构稳定,水溶性好,其α-螺旋结构在水中有序排列可以增强蛋白结构稳定性,能最大限度地减少蛋白降解,这将在新型天然防腐剂和新医疗领域有不可限量的发展前景。LL-37是来源于人体唯一的cathelicid
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研究表明抗菌肽Antibacterial peptide（AMP）种类繁多、且来源广泛,普遍存在于自然界中,AMP具有广谱抑菌活性及较高的杀菌能力。其分子量小、容易被代谢,抑菌作用快而不易产生耐药性,结构稳定,水溶性好,其α-螺旋结构在水中有序排列可以增强蛋白结构稳定性,能最大限度地减少蛋白降解,这将在新型天然防腐剂和新医疗领域有不可限量的发展前景。LL-37是来源于人体唯一的cathelicidins家族的抗菌肽,因为其氨基酸总数为37个,且前两个氨基酸为亮氨酸（L）而被命名为LL-37,分子量约为4.5KD,是一类阳离子多肽,在人体免疫反应中发挥着重要的作用。但是采用化学合成的方法得到的抗菌肽成本较高、且得率和活性不高,这就制约着LL-37的大规模应用;毕赤酵母SMD1168H是蛋白酶基因缺失的菌株,用它作为基因工程宿主菌可以降低蛋白质的水解,且利用酵母系统来表达LL-37,可以直接分泌到胞外,简化了后续的纯化工艺。方法:本研究获得阳性克隆后,通过单因素试验及正交试验方法得到重组菌的最优表达条件;采用离子交换层析的方法来纯化工程菌表达的LL-37,用高效液相色谱及质谱来鉴定表达产物LL-37;以金黄色葡萄球菌和大肠杆菌为受试菌来测定其最小抑菌浓度,最后将LL-37应用到鲜榨果汁及牛奶中进行防腐保鲜的初步应用试验。结果表明:（1）基因工程重组菌p GAPZαA-LL-37-17/SMD1168的最优培养基及比例为:氮源与碳源比为4:1,氮源中酵母粉与硫酸铵比例为2:1;其最优的表达条件为:表达温度为28℃、培养时间为36h,表达时转接的初始菌种量为2m L/25m L,摇瓶转速为200rpm/min,LL-37的最终表达量可以达到上清液中总蛋白的79%。（2）发酵后的上清液经过3000D的超滤膜超滤浓缩及1000D的透析袋进一步除杂后,低于4.5KD的小分子被基本除去;采用阴离子交换色谱柱（Q柱）来纯化除杂,Q柱可以结合上清液中的大部分带负电的杂蛋白,通过高效液相色谱检测得出其纯度可以达到80%。（3）经过抑菌活性检测可知,LL-37对大肠杆菌的最小抑菌为51.2ug/m L和金黄色葡萄球菌的最小抑菌为40ug/m L;将LL-37应用到牛奶和鲜榨果汁中能够明显抑制微生物的生长,为LL-37在鲜榨果汁中的初步应用奠定了基础。
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