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第一部分:垂体泌乳素腺瘤细胞对卡麦角林与溴隐亭的药物敏感性研究目的:研究不同的垂体泌乳素腺瘤细胞系对卡麦角林(Cabergoline,CAB)与溴隐亭(Bromocriptine,BRC)两种多巴胺受体激动剂(Dopamineagonists,DAs)的药物敏感性。方法:应用CCK8检测两种药物在不同浓度、不同时间点分别对垂体泌乳素腺瘤GH3和MMQ两种细胞系的增殖抑制情况并计算药物IC50值。结果:1.CAB与BRC分别处理GH3细胞48小时后,BRC的IC50值(55.61±4.19μM/L)明显小于 CAB 的 IC50 值(84.29±9.16μM/L)(P<0.01)。2.CAB 与 BRC 分别处理 MMQ 细胞 48 小时后,CAB 的 IC50 值(27.44±10.21μM/L)明显小于 BRC 的 IC50 值(90.34±7.93μM/L)(P<0.001)。结论:GH3细胞对BRC的药物敏感性要高于CAB,MMQ细胞对CAB的药物敏感性要高于BRC。第二部分:卡麦角林与溴隐亭治疗垂体泌乳素腺瘤细胞的差异性细胞死亡机制目的:研究垂体泌乳素腺瘤细胞对CAB与BRC药物敏感性差异的细胞死亡机制。方法:1.应用透射电镜观察CAB与BRC在一定药物浓度下诱导GH3和MMQ细胞48小时后自噬小体的数量。Western blot检测CAB与BRC在不同药物浓度下诱导GH3和MMQ细胞48小时后自噬相关蛋白LC3的表达水平。2.流式细胞仪检测CAB与BRC在一定药物浓度下分别诱导两种细胞系的凋亡变化。Western blot检测CAB与BRC在不同药物浓度下诱导GH3和MMQ细胞48小时后凋亡相关蛋白cleaved-caspase-3的表达水平。3.PI3K抑制剂(3-MA)分别抑制CAB与BRC诱导GH3和MMQ细胞的自噬作用。透射电镜观察抑制自噬作用后胞质自噬小体的数量变化。Western blot检测抑制自噬作用后LC3的表达变化。CCK8观察抑制自噬作用后细胞存活率的变化。4.Caspase抑制剂(Z-VAD-FMK)分别抑制CAB和BRC诱导GH3细胞的凋亡作用。流式细胞仪检测凋亡抑制后细胞的凋亡变化。Western blot检测抑制凋亡后cleaved-caspase-3的表达变化。CCK8观察抑制凋亡作用后细胞存活率的变化。结果:1.CAB与BRC分别诱导GH3和MMQ细胞系自噬小体的数量都要明显高于对照组(P<O.O01,P<0.05),并且CAB诱导两种细胞自噬小体的数量要明显高于BRC组(P<0.01)。CAB与BRC均可诱导GH3和MMQ细胞LC3I向LC3II的转化,并且CAB诱导两种细胞系LC3I向LC3II的转化率要明显高于BRC(P<0.001)。2.CAB与BRC分别诱导GH3和MMQ细胞的凋亡率均明显高于对照组(P<0.05,P<0.001),并且BRC诱导两种细胞的凋亡率均要明显高于CAB组(P<0.01)。CAB与BRC分别诱导GH3和MMQ细胞cleaved-caspase-3的表达水平均要明显高于对照组,并且在一定药物浓度下BRC诱导GH3细胞cleaved-caspase-3的表达水平要明显高于CAB。3.抑制CAB与BRC诱导GH3细胞的自噬作用,自噬小体的数量均明显降低(P<0.001,P<0.01),LC3I向LC3II的转化率也均明显降低,CAB组的两种细胞系的存活率均要明显高于对照组(P<0.05,P<0.001),而BRC组的两种细胞存活率均没有明显变化(P>0.05,P>0.05)。4.抑制CAB与BRC诱导GH3细胞的凋亡作用,细胞凋亡率均明显降低(P<0.05,P<0.05),cleaved-caspase-3的表达水平也均明显降低,两种细胞系的细胞存活率均明显升高。结论:BRC诱导垂体泌乳素腺瘤细胞死亡以细胞凋亡为主,CAB诱导垂体泌乳素腺瘤细胞死亡以自噬性细胞死亡为主。第三部分:卡麦角林与溴隐亭治疗垂体泌乳素腺瘤细胞的差异性分子机制目的:研究BRC诱导垂体泌乳素腺瘤细胞凋亡及CAB诱导垂体泌乳素腺瘤细胞自噬的分子机制方法:1.基因芯片筛查CAB和BRC诱导GH3和MMQ细胞差异基因的表达,qRT-PCR和Western blot验证差异基因的表达水平。2.EGR1的siRNA与慢病毒包裹,转入GH3和MMQ细胞,RT-PCR和Western blot验证两种细胞系EGR1沉默后的表达水平。CCK8检测EGR1下调后,BRC诱导两种细胞存活率的变化。3.观察BRC对裸鼠皮下移植瘤的增殖抑制情况,移植瘤组织TUNEL染色检测细胞凋亡,免疫组化染色检测ERK1/2及EGR1的阳性表达水平。4.Western blot检测CAB诱导GH3和MMQ细胞p-AKT及p-mTOR的表达水平。结果:1.基因芯片筛查及qRT-PCR验证结果表明BRC诱导GH3和MMQ细胞EGR1的表达水平要明显高于对照组(P<0.05,P<0.01)。BRC诱导两种细胞p-ERK1/2及EGR1蛋白表达水平均明显高于对照组(P<0.05)。2.将包裹EGRlsiRNA的慢病毒转入GH3细胞后,EGR1的mRNA水平及蛋白水平均明显降低,两种细胞系的存活率均高于对照组(P<0.001,P<0.01)。3.BRC 处理组的肿瘤体积(control:689±113.15mm3 vs BRC:65.58±17.85mm3;P<0.001)及质量(control:1.29±0.13gvs BRC:0.28±0.03g;P<0.001)均明显小于对照组。实验组TUNEL染色阳性率,EGR1、ERK1/2的阳性表达率均要明显高于对照组(P<0.01,P<0.05,P<0.05)。4.CAB明显抑制两种细胞的p-AKT及p-mTOR表达水平(P,0.001,P<0.001)。结论:BRC通过ERK1/2-EGR1信号通路诱导垂体泌乳素腺瘤细胞凋亡,CAB通过抑制AKT/mTOR信号通路引起垂体泌乳素腺瘤细胞自噬性细胞死亡。