第一部分RRV感染不同年龄小鼠后,肝脏NK细胞活化的差异摘要目的：明确不同年龄小鼠感染了RRV后,小鼠肝脏NK细胞活化能力的差异；方法：不同年龄小鼠腹腔注射RRV24小时后,磁珠分选法提取肝脏NK细胞,通过流式细胞仪检测NK细胞活化后表达细胞因子CD69、TFN-a和IFN-y的能力,并进行统计学分析。结果：与未感染RRV的新生小鼠相比,感染RRV的新生小鼠肝脏NK细胞活化后表达细胞因子CD69、TFN-a和IFN-y的能力明显升高,P<0.05,有统计学意义；同样,感染了轮状病毒的成年小鼠肝脏NK细胞活化后分泌细胞因子CD69、TFN-a和IFN--γ的能力也明显上调,P<0.05,有统计学意义。但是,与感染了RRV的成年小鼠肝脏NK细胞相比,感染RRV的新生小鼠肝脏NK细胞活化后分泌细胞因子CD69、TFN-a和IFN-γ,的能力却明显不足,P<0.05,有统计学意义。结论：本实验说明,RRV可诱导小鼠肝脏NK细胞活化后分泌炎性细胞因子上调,但新生小鼠肝脏NK细胞的活化能力明显低于成年小鼠。然而随着新生小鼠年龄的增长,新生小鼠肝脏NK细胞逐渐成熟,其活化后分泌炎症因子的能力也逐渐增强。第二部分新生小鼠Kupffer细胞分离培养及吞噬活性测定摘要目的建立一种新生小鼠肝脏库普弗(Kupffer)细胞分离、培养的简便方法,为BA发病机制的研究提供可靠的实验细胞。方法取6-8个新生小鼠肝脏置于200目研磨网上剪碎并研磨后,将研磨液种植于无菌细胞培养瓶A中。培养3-4d后将贴壁细胞再次悬浮并种植于另一无菌培养瓶B中,将培养瓶B置于含5%CO2细胞培养箱培养45min后1XPBS缓冲液洗细胞,获得二次贴壁细胞并行F4/80免疫荧光鉴定。二次贴壁细胞与2um荧光小球共培养1h后,1XPBS缓冲液清洗细胞,处理完后置于激光共聚焦显微镜下观察。结果巨噬细胞标志物F4/80免疫荧光法检测二次贴壁细胞,阳性率>99%,活性99%,细胞获得1×107/L。二次贴壁细胞与2um荧光小球共培养,可见胞浆中吞噬有大量荧光小球。结论“二次贴壁法”选择性贴壁从新生小鼠肝脏获取Kuppfer细胞,取材容易,操作方便,不需特殊设备,可满足新生小鼠胆道闭锁发病机制研究的实验需求,实验价值高。第三部分依赖于IL-4、IFN-γ不同年龄小鼠肝脏NK对MΦ调控的差异摘要目的：以前的研究发现新生小鼠肝脏NK细胞的活化能力不足,而活化的NK细胞是细胞因子IFN-γ和IL-4的主要来源,希望通过明确MΦ细胞活化对细胞因子IFN-y和IL-4剂量依赖性,进而明确新生小鼠肝脏NK细胞对MΦ细胞的调控存有无异常。方法：细胞因子IFN-γ可辅助MΦ细胞活化并表达细胞因子iNOS和TNF-a,而IL-4可辅助MΦ细胞活化分泌细胞因子IL-10。MΦ细胞与不同剂量细胞因子IFN--γ共孵育12小时后,通过实时PCR(real time PCR,RT-PCR)和印迹实验(westblot,WB)两种检测方法分别检测细胞因子iNOS和TNF-a基因转录和蛋白表达与IFN-y剂量关系；通过酶联免疫吸附法(ELISA)及RT-PCR法检测MΦ细胞与不同剂量IL-4共孵育12小时后IL-I0基因转录和蛋白表达与IL-4剂量关系。MΦ细胞分别来源于新生小鼠肝脏和成年小鼠肝脏。结果：MΦ细胞与不同剂量IFN-γ共孵育12小时后,其胞内细胞因子iNOS和TNF-a的基因转录和蛋白表达量均随着IFN-y剂量的增加而呈递增趋势；同样,随着IL-4浓度的增加,MΦ细胞胞内IL-I0基因转录和蛋白表达量也逐渐递增,但当IL-4浓度达到100u/L时,IL-10基因转录和蛋白表达量达到峰值,随后逐渐降低。而且,无论新生小鼠肝脏MΦ细胞或成年小鼠肝脏MΦ细胞,它们均有类似表现。结论：MΦ细胞的活化程度对细胞因子IFN-γ和IL-4具有剂量依赖性,在一定范围内,随着细胞因子IFN-γ和IL-4剂量的增加,其分泌炎性细胞因子的能力逐渐增强。而活化的NK细胞是细胞因子IFN-γ和IL-4的主要来源,已明确新生小鼠肝脏NK细胞的活化能力不足,分泌IFN-γ和IL-4等细胞因子能力下降,新生小鼠肝脏NK细胞对MΦ细胞的调控因而存在异常。第四部分不同年龄小鼠肝脏NK细胞对吞噬RRV的MΦ细胞杀伤差异摘要目的：通过比较不同年龄小鼠肝脏NK细胞对吞噬了RRV的MΦ细胞的杀伤活性差异,从而进一步确定了新生小鼠肝脏NK对MΦ细胞调控能力不足。方法：通过磁珠分选法及差别贴壁法分别获取野生型B6成年小鼠和新生小鼠肝脏NK细胞与MΦ细胞。把来源于不同年龄段小鼠肝脏NK细胞及是否事先经过HMGB1活化过分为A、B、C、D四组,然后将不同组NK细胞分别与吞噬了RRV的不同年龄段小鼠肝脏MΦ细胞共培养4小时后,采用非放射性细胞毒试验检测不同组肝脏NK细胞对吞噬RRV后的肝脏MΦ杀伤活性。结果：新生小鼠肝脏NK细胞经细胞因子HMGB1活化后,其对吞噬RRV的不同年龄段小鼠肝脏MΦ细胞杀伤能力均明显增强,P<0.05,有统计学意义；同样,经细胞因子HMGB1活化后的成年小鼠肝脏NK细胞,其对吞噬了RRV的不同年龄段小鼠肝脏MΦ细胞杀伤能力也明显增强,P<0.05,有统计学意义。但与成年小鼠肝脏NK细胞相比,新生小鼠肝脏NK细胞对吞噬RRV的MΦ细胞杀伤能力明显明显不足,P<0.05,有统计学意义。然而随着小鼠年龄的增加,NK细胞逐渐成熟,其杀伤活性可逐渐增强。结论：新生小鼠肝脏NK细胞对吞噬了RRV的MΦ细胞杀伤能力不足,不能有效清除吞噬RRV的MΦ细胞,导致RRV在体内持续存、繁殖并扩散至周围组织,从而造成胆管上皮细胞大量受损及慢性炎症的形成,继而形成BA。