糖尿病肾病（diabetic nephropathy,DN）是糖尿病最常见的微血管并发症之一,目前DN的发病机制尚不清楚,亦缺乏有效的治疗手段。因此,有效地预防、治疗DN已成为医学领域中极为重要的问题。DN的发生是多种因素综合作用的结果。其中miRNAs作为一类小分子非编码RNA,由于其存在的普遍性以及所参与的调控过程的复杂性,成为近年来研究的热点。已有研究显示miRNAs在糖尿病微血管并发症发病中起重要作用。miR-192作为在肾脏特异性表达的miRNA之一,可以经由其TGF-β₁介导通路参与DN的细胞外基质（ECM）蛋白蓄积进程,可能机制为:TGF-β₁正调节miR-192,miR-192减量调节SIP1,导致CollgenⅠ过度表达,蛋白蓄积。SIP1的3’UTR为miR-192调控靶点,miR-192通过mRNA降解途径减少SIP1表达。TGF-β₁诱导miR-192表达的机制尚待进一步探讨,有证据显示miR-192启动子存在高度保守的上游区est-1原癌基因结合位点,而TGF-β₁也诱导调控est-1表达,est-1在肾脏发育、保持肾小球完整性及基质金属蛋白酶表达中都是必需的,由此推断,TGF-β₁可能是通过est-1调控miR-192。西医在治疗DN上主要是控制高血糖、减少蛋白尿、控制高血压等对症治疗,但迄今尚未有能完全阻断DN进展的药物。因此,发挥中医药治疗特色和优势,积极探求中医药治疗DN的有效方法,防止或延缓其发展具有重要的意义。DN属于中医的“肾消”、“水肿”、“肾劳”、“关格”等范畴。脾肾虚是DN的发病基础,痰湿、浊毒、瘀血等是其发展过程中的促进因素,本虚标实是DN的病机特点。DN早期（Ⅲ期）多表现阴虚或气阴两虚;DN临床期（Ⅳ期）多表现脾。肾亏虚、水湿内停或夹瘀血阻络;DN终末期（Ⅴ期）多表现脾肾阴阳衰败、浊毒中阻。因此,对Ⅲ～Ⅳ期DN的治疗以益气健脾、滋。肾养阴兼活血通络为法。中药复方制剂。肾康丸由黄芪、芡实、金樱子、水蛭、益母草等药物组成,功能益气健脾、补肾固涩,利尿消肿,活血通络,符合Ⅲ～Ⅳ期DN的病因病机,具有标本兼治之功。肾康丸作为医院制剂,在临床治疗DN患者多年,疗效确切。临床观察和动物实验研究都表明,该药在一定程度上可以改善DN一般症状,保护肾脏,延缓DN的进展。但其治疗DN的分子水平的作用机制还不清楚,有待进一步研究。因此,本课题通过动物实验,从miR-192及其TGF-β₁介导途径出发,探讨肾康丸治疗DN的分子基因水平的作用机制,为其临床应用提供实验依据。具体如下:第1部分肾康丸对DN大鼠的肾脏保护作用目的:观察肾康丸对DN大鼠模型的治疗及肾脏保护作用,为进一步研究药物作用机制提供实验依据。方法:首先用链脲佐菌素（STZ）按55mg·kg-1大鼠体重一次性腹腔内注射法建立大鼠DM模型,连续喂养2周,测血糖、尿蛋白、尿量。若血糖值＞16.6mmol/L、尿量＞原尿量150%、尿蛋白排泄＞30mg/kg/24h,则造模成功,计算成模率。大鼠造模成功后,称重,随机分为4组:模型对照组、肾康丸组、开博通组和胰岛素组,另设正常对照组。肾康丸组大鼠实验用量设定为1.1g·kg-1大鼠体重,肾康丸研磨后用蒸馏水配成0.22g·mL-1混悬液。开博通片组大鼠实验用量设定为4.5mg·kg-1大鼠体重,开博通片研磨后用蒸馏水配成0.9mg·mL-1溶液。肾康丸组和开博通组大鼠按5mL·kg-1体重,灌服相应药液;模型对照和正常对照组大鼠灌服等容积生理盐水。每日1次,连续8w。胰岛素组以血糖11.1mmol/L为基准每日皮下注射胰岛素8～40u控制血糖。各组大鼠自由进食饮水,实验中除胰岛素组外,其他各组不予任何降血糖药物。治疗8周,治疗期间及治疗后观察大鼠一般状况、血糖、尿糖。末次给药后计24h尿量和饮水量,然后用10%水合氯醛腹腔麻醉大鼠,腹主动脉穿刺采血,分离血清,全自动生化分析仪检测大鼠血尿素氮（BUN）、血肌酐（Scr）、血总胆固醇（TC）、血甘油三酯（TG）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-c）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-c）;用紫外分光光度法检测糖化血红蛋白（GHb）;放免法检测血清胰岛素和血清胰高血糖素含量与血栓素（TXB₂）、6-酮-前列环素(6-keto-PGF_la)、内皮素（ET）;考马斯亮兰法检测24h尿蛋白（Upro）;取大鼠肾脏,观察肾脏大小,计算肾重、相对肾重,并通过HE染色法观察大鼠肾脏组织病理变化。结果:1.55只大鼠用于造模,成模率80%（44/55）,成模后病死率4.55%（2/44）。2.8周治疗期间,模型组大鼠血糖均维持在16.7mmol·L-1以上,尿糖+++以上;表现出多饮、多食、多尿、消瘦的DM症状,。肾康丸、开博通及胰岛素治疗组大鼠一般情况均较模型对照有所改善;3.正常对照组及各治疗组大鼠体重均较治疗前增加（P＜0.01）,模型对照组大鼠体重未增,且较各治疗组降低（P＜0.01）。4.与正常对照组比较,各组大鼠血糖、GHb、24hUpro、Scr、BUN、TC、TG、LDL-c、胰高血糖素均升高,24h尿量及饮水量增加;与模型对照组比较,肾康丸、开博通及胰岛素治疗均可以降低24hUpro、BUN及24h尿量及饮水量;肾康丸与胰岛素治疗可以降低血糖、GHb和胰高血糖素（P＜0.01）。仅肾康丸组TC、TG、LDL-c明显下降（P＜0.01）。5.与正常对照组比较,各组大鼠HDL-c、胰岛素水平显著降低（P＜0.01）。仅肾康丸治疗组与模型对照组相比,对HDL-c具有显著升高作用（P＜0.01）;肾康丸与胰岛素治疗均可提高胰岛素水平（P＜0.01）。6.与正常对照组比较,DM各组大鼠TXB₂、ET水平均显著升高,6-keto-PGF_la均显著降低（P＜0.01）。而较之模型组,肾康丸组TXB₂、ET水平明显下降（P＜0.01）,对6-keto-PGF_la肾康丸组则有显著的恢复作用（P＜0.01）。开博通、胰岛素治疗对上述指标无改善。（P＞0.05）7.与正常对照组比较,模型组大鼠肾重及相对肾重增加（P＜0.01）,且出现了相当于Mogensen分期的3期左右DN病理损害。肾康丸、开博通和胰岛素组病理改变较模型组均有不同程度的减轻,其中肾康丸组效果更为显著。结论:1.肾康丸能够改善实验性DN大鼠一般状态,具有一定的调节血糖、血脂代谢的作用。2.肾康丸能够促进胰岛素分泌,降低胰高血糖素。3.肾康丸能够降低实验性DN大鼠尿蛋白,抑制血清BUN及Scr,具有一定的保护肾功能作用。4.肾康丸能够降低TXB₂水平,提高6-keto-PGF_la水平,恢复TXB₂与6-keto-PGF_la的平衡。5.肾康丸能够降低血浆ET水平,缓解血管内皮损伤。6.肾康丸能够改善肾脏组织病理学改变,在一定程度上缓解肾脏病理损伤。第2部分肾康丸对DN大鼠miR-192信号通路的影响目的:探讨肾康丸对DN大鼠肾脏miR-192及其TGF-β₁介导通路的影响。方法:取第一部分各组大鼠左肾组织,沿正中矢状面剖开,用PBS冲洗干净,除去包膜,投入10%甲醛中性缓冲液中固定,应用SP（过氧化物酶标记的链霉卵白素Streptavidin/Peroxidase）法进行免疫组织化学染色,分别以兔抗大鼠TGF-β₁、Collagen1和SIP1多克隆抗体为一抗,检测肾脏组织TGF-β₁、Collagen1和SIP1蛋白的表达。取第一部分各组大鼠右肾组织,PBS冲洗干净后,-70℃冻藏,20mg左右肾组织冰浴中匀浆后溶解于300μL裂解液RL中,按试剂盒说明书提取总RNA。取1.5μg总RNA采用M-MLV转录成cDNA,采用SYBR PremixEx Taq^TM在FTC-2000型实时荧光定量PCR仪上进行荧光定量PCR,内参照采用GAPDH,检测肾脏组织TGF-β₁、Collagen1、SIP1和miR-192 mRNA表达。结果:1.正常组大鼠肾脏在肾小管上皮细胞中有少量TGF-β₁蛋白表达;与正常组大鼠相比,模型组在肾小管上皮细胞和髓质的TGF-β₁蛋白表达量明显增加;与模型组相比较,肾康丸、开博通和胰岛素治疗可以减少TGF-β₁蛋白表达,其中肾康丸组效果更明显。2.Collagen1蛋白在正常组肾小球内无表达,在肾小囊、肾小管散在表达;模型组则在肾小球内、肾小囊、肾小管表达增加;肾康丸组、开博通组和胰岛素组肾小球内无表达,肾小囊、肾小管表达量较模型组减少。3.SIP1蛋白在正常组肾小囊内无表达,在肾小球、肾小管、肾髓质表达明显;模型组表达量减低;肾康丸、开博通和胰岛素治疗后可以增强SIP1表达。4.与正常组比较,模型组大鼠肾脏TGF-β₁、Collagen1、miR-192 mRNA表达量增加,而SIP1 mRNA表达降低;肾康丸组与开博通组可以降低TGF-β₁、Collagen1、miR-192 mRNA表达,提高SIP1 mRNA表达。结论:1.肾康丸可以降低造模后升高的TGF-β₁ mRNA及蛋白表达;2.肾康丸可以下调Collagen1mRNA和蛋白表达;3.肾康丸可以上调DN降低的SIP1mRNA和蛋白表达;4.肾康丸可以降低造模后升高的miR-192的表达。全文结论:本研究通过DN动物模型实验研究,再次证明肾康丸具有治疗DN和保护肾脏的作用;其作用机理与药物抑制miR-192及其TGF-β₁介导通路的活性,减少ECM的分泌与基因合成有关。为肾康丸应用于DN的临床治疗,提供了较为全面、深入的分子水平作用机制的理论和实验依据。