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第一部分大鼠BMSCs对DCs表型的影响及CD45RB~+DCs免疫功能的检测目的:研究大鼠骨髓间充质干细胞(Bone mesenchymal stem cell,BMSCs)对同种异体骨髓来源的树突状细胞(Dendritic cells,DCs)表型的影响,以及受影响显著的CD45RB~+DC亚细胞群的免疫状态。方法:Wistar大鼠的BMSCs和同种异体骨髓来源的树突状细胞(DCs)在体外按等比例进行5d的共培养。根据是否加入BMSCs共同培养,我们将实验分为对照组和实验组两个组别:A组:内毒素脂多糖(LPS)与DCs共培养组,B组:在A组基础上加入BMSCs与DCs共培养组(细胞数量1:1)。对两组DC细胞表面的主要免疫标志物分子的变化情况应用流式细胞仪进行测定和分析,同时观察DCs在光镜下形态学上的改变。利用流式细胞技术分离出大鼠BMSCs诱导的CD45RB~+DC细胞群,实验组共分三组:A组:未成熟DC组,B组:CD45RB~+DC组,C组:成熟DC组。检测各组细胞表面主要共刺激分子(CD80、CD86、MHC-II)的表达,各组DC摄取抗原的能力(对bead-OVA复合物的摄取)、qPCR方法测各组DC细胞中FOXP3 mRNA的表达,Western Bloting检测各组Foxp3蛋白的表达。结果:和对照组相比,CD45RB、lLT4的表达在BMSCs共培组中DCs表面表达发生上升,而CD86、MHC-II的表达出现下降;同时,CD45RB~+组低表达共刺激分子CD80、CD86和MHC-II,呈现出未成熟DC的表征;与此同时CD45RB~+组与未成熟DC组的摄取能力也要强于成熟DC组(P<0.05),CD45RB~+DC组与imDC组FOXP3 mRNA及Foxp3蛋白的表达均明显多于mDC组(P<0.05)。结论:BMSCs体外诱导下可以使DCs表面CD45RB与ILT4的表达上调,并导致cd86与mhc2的表达下调,尤其以cd45rb的改变最为明显。经bmscs诱导的cd45rb+dcs摄取抗原的能力明显增强,其foxp3mrna及foxp3蛋白的表达出现上调,呈现出imdc的免疫行为特征。第二部分cd45rb+dcs对t细胞功能影响的体外实验研究目的:通过体外dcs细胞和t淋巴细胞的共培养,分别检测不同dcs细胞对t淋巴细胞增殖能力的影响和其对t淋巴细胞亚群的影响。方法:用wistar大鼠的dcs和sd大鼠的cd4+t细胞进行共培养,包括以下几组。a组:con组为阴性对照组,即sd大鼠的cd4+t细胞,b组:cona为阳性控制组,即sd大鼠分选后的cd4+t细胞给予cona刺激(浓度10ng/ml),c组:在cona阳性控制组的基础上,加入wistar大鼠未成熟dcs进行细胞共培养(dc:t=1:10),d组:在cona阳性控制组的基础上,加入wistar大鼠cd45rb+dcs进行细胞共培养(dc:t=1:10),e组:在cona阳性控制组的基础上,加入wistar大鼠成熟dcs进行细胞共培养(dc:t=1:10)。共培养72h后,取各组cd4+t细胞进行功能检测,包括以cck-8法测定t淋巴细胞的扩增情况;初始th细胞向th1、th2、th17、treg的分化:提取rna之后采用qpcr分别测定相应的特异转录因子t-bet、gata-3、rorγt、foxp3的表达。流式细胞仪检测各组cd4+foxp3+t细胞数量。流式cba法检测培养上清中的il-2、ll-4、il-10、ll-17a、lfn-γ、tnf-α和ll-6等细胞因子表达水平。结果:细胞共培养后,cd45rb+dcs组t细胞增殖能力明显下降,组间有显著差异;同时cd45rb+dcs组cd4+foxp3+t细胞的数量增加,与对照组间有统计学差异(p<0.05);cd45rb+dcs组和imdcs组特异性转录因子foxp3和t-bet表达上升,gata-3和r0rγ表达下降,ll-2和lfn-γ水平降低,ll-4、ll-10以及tgf-β1水平升高,与对照组间存在明显差别(p<0.05)。结论:大鼠cd45rb+dcs在体外明显抑制反应性t淋巴细胞的增殖,促进初始th0细胞向th2的方向分化倾斜,并能提升调节性t细胞的比例,进而增强t细胞的免疫抑制能力。第三部分cd45rb+dcs静脉输注诱导同种移植免疫耐受的实验研究目的:研究大鼠cd45rb+dcs移植预处理方法诱导大鼠同种异体心脏移植免疫耐受的作用。方法:首先建立wistar大鼠幼鼠至sd大鼠同种异体颈部心脏移植模型。在移植的5天前,对受体大鼠进行相应的细胞静脉注射。分组:a组(对照组):只行颈部同种异位心脏移植;b组(imdcs注射组):受体大鼠经静脉注射供体大鼠未成熟dc细胞1×106/0.2ml;c组(cd45rb+dcs注射组):受体大鼠经静脉注射供体大鼠cd45rb+dc细胞1×106/0.2ml;d组(mdcs注射组):受体大鼠经静脉注射供体大鼠成熟dc细胞1×106/0.2ml。用触诊法监测移植心脏的存活时间。分别在移植后的第1、3、5d将移植物中的淋巴细胞进行分离并提取rna,对microrna-182、microrna-183、microrna-7a、microrna-155、microrna-434、ll-2、lfn-γ、ll-4、ll-10的表达水平用定量rt-pcr进行测定。另外分别取受体血清,流式细胞技术测定cd4+foxp3+t淋巴细胞的比值。结果:同种异体心脏移植之后,cd45rb+dcs组和未成熟dcs组移植物存活时间延长明显,与对照组相比差异显著(p<0.05),随着时间的推移,cd4+foxp3+t淋巴细胞比率呈现逐渐升高趋势,在术后第5d改变明显(p<0.05)。随着心脏移植后时间的推移,microrna-7a、microrna-182以及microrna-183水平逐渐升高,mir-434表达水平则逐渐降低,在移植后的不同时间点上均有统计学差异,但同一天各组间未见明显差别。第3、5dcd45rb+dcs组和imdcs组microrna-155表达增加,和对照组之间有统计学差异(p<0.05)。心脏移植后得第5d,ll-4水平在cd45rb+dcs组和未成熟dcs组中的表达均上升,ll-2和lfn-γ水平则呈现下降趋势,与对照组相比统计学差异显著(p<0.01);同时il-10水平在cd45rb+dcs组升高明显,与对照相比有明显差异(p<0.01)。结论:cd45rb+dcs通过上调体内cd4+foxp3+调节性t细胞的数量,下调移植受体大鼠microrna-155的表达,增加移植物内淋巴细胞ll-10和ll-4水平,并降低lfn-γ和ll-2水平,从而显著延长移植心脏的存活时间。