恶性肿瘤是增殖失控和异常分化的细胞集合体,其发生发展与胚胎发育的生命过程极为相似。研究证实,在胚胎早期和着床前后胚胎微环境的独特性不仅对胚胎组织发挥着精细有序的调控,也能有效地调控肿瘤细胞的生物学行为。本实验着眼于中晚期胚胎微环境,从发育生物学视角探讨小鼠中晚期胚胎与恶性肿瘤细胞的相互作用,旨在为胚胎微环境能逆转恶性肿瘤细胞生物学行为的理论提供新的实验依据。目的:(1)观察中晚期胚胎腹腔种植恶性肿瘤细胞H22的仔鼠分娩、发育及荷瘤现象,初步探讨小鼠中晚期胚胎与恶性肿瘤细胞H22的相互作用。(2)观察胚胎期腹腔和出生后皮下两次种植H22细胞的小鼠生长发育及荷瘤现象,对过程中胚胎腹腔微环境的作用进行初步探讨。(3)观察不同孕期小鼠羊水对小鼠肝癌细胞H22增殖和凋亡的影响,探讨羊水是否是实现胚胎微环境对恶性肿瘤细胞实施调控的介质之一。方法:(1)妊娠14~19天(D14~D19)KM小鼠,行宫内胎鼠腹腔种植小鼠肝癌细胞H22(20ul,1×106个)。观察胎鼠分娩、发育情况,观察形态、运动协调功能、反射感觉功能和认知能力是否正常,观察平面反射、耳阔分离、悬崖回避、强握金属线、听觉惊愕、睁眼时间、睾丸下降和阴道开口的时间;测量出生后1~60天的体重;对皮下肌肉、肺、肝和肾脏等组织行石蜡切片HE染色、光学显微镜下观察荷瘤情况。(2)将宫内腹腔种植H22细胞(20ul,1×106个)的D15孕鼠分娩的新生鼠皮下种植H22细胞(20ul,1×106个)作为实验组;胚胎期未种植H22细胞的新生鼠为对照组;胚胎期腹腔种植H22细胞的新生鼠为空白组。观察分娩、发育情况,观察形态、运动协调功能、反射感觉功能和认知功能、及平面反射、悬崖回避和强握金属线能力是否正常、耳阔分离、听觉惊愕、睁眼时间、睾丸下降和阴道开口的时间;测量出生1~4周仔鼠的体重;对皮下肿块、肺、肝和肾脏行常规病理检查了解荷瘤情况,并测量肿块长、短径,计算肿瘤体积和相对增殖率。(3)采用MTT法检测孕11、13、15和17天小鼠羊水-RPMI1640培养液培养的H22细胞的增殖能力;Annexin V-FITC法检测细胞凋亡率,透射电镜观察细胞形态;S-P免疫荧光染色法经激光共聚焦显微镜分析H22细胞中增殖细胞核抗原(PCNA)和P53的表达。结果:(1)D14~D19胎鼠腹腔种植H22细胞时间越晚,分娩孕鼠数量越多。分娩率和胚胎期胎儿死亡率与对照组均无显著差异(P>0.05)。D14~D19仔鼠分别有57.9%、53.7%、51.8%、39.4%、18.7%和8.3%正常发育至成年,运动协调功能、反射感觉和认知功能和平面反射、悬崖回避、强握金属线能力正常;耳阔分离、听觉惊愕、睁眼时间、睾丸下降和阴道开口时间以及出生30天和60天的体重,与正常发育组比较均未见异常(P>0.05)。与实验组无荷瘤仔鼠比较,荷瘤仔鼠的运动协调功能、反射感觉功能和认知能力下降,平面反射能力、耳阔分离时间未见异常,但悬崖回避和强握金属线的能力降低、听觉惊愕和睁眼时间晚、出生1~4周的体重增高(P<0.05)。D14~D16实验各组仔鼠解剖未见肉眼肿瘤,组织学检测光镜下观察肺、肝和肾脏未见异常。D17、D18和D19实验各组分别有5.6%、40.3%和46.9%仔鼠发育过程中发生肿瘤,且随H22细胞种植时间越迟荷瘤率越高(P<0.05);出生后7d肉眼见种植部位有肿块出现,腹部膨隆,解剖见腹腔腹水,以D19组最多。组织学检测光镜下见肺脏、肝脏内癌细胞成巢团状,核大、核仁明显,见较多核分裂像,易见病理性核分裂像,但肾脏未见异常。(2)与空白组比较,实验组和对照组仔鼠运动协调功能、反射感觉功能和认知能力均降低;仔鼠的平面反射、耳阔分离未见异常,但悬崖回避和强握金属线能力降低、听觉惊愕和睁眼时间晚(P<0.05),且实验组睾丸下降和阴道开口时间比空白组晚(P<0.05)。出生1-4周的体重,实验组和对照组均明显高于空白组,且对照组最高(P<0.05)。实验组和对照组仔鼠总死亡率为100%,空白组为40.3%;实验组和对照组的每周死亡率均明显高于空白组,其中对照组第1、2周死亡率最高(P<0.05)。实验组仔鼠皮下种植H22细胞7d后,可见种植部位有肿块出现,其他部位未见肉眼荷瘤,而对照组接种4d后可见相应肿块出现。实验组与对照组比较肿瘤发生晚,但肿瘤增殖速率无明显差别(P>0.05)。组织学观察可见实验组和对照组仔鼠皮下肿块内大量成巢团状癌细胞以及胸腔内散在癌细胞团、部分肺脏荷瘤,癌细胞异型性明显,核大、核仁明显、较多核分裂像、易见病理性核分裂像,肝脏和肾脏均未见异常。实验组肺脏荷瘤比例小于对照组(P<0.05);(3)孕11、13、15和17天羊水能显著抑制H22细胞的体外增殖和PCNA的表达,随孕期的延长而增高(P<0.05);并能促进P53的表达以及诱导H22细胞凋亡,随孕期的延长而降低(P<0.05)。同时,PCNA和P53的表达强度具有明显的负相关性(r=-0.808,P<0.01)。结论:(1)发育中的中晚期胚胎能降低肿瘤细胞H22的侵袭性和成瘤力,并具有时序性;肿瘤细胞H22能影响晚期胚胎发育。(2)胚胎期和出生后两次种植H22细胞的小鼠,比胚胎期未种植H22细胞的小鼠肿瘤发生时间晚,自然存活时间长,可能与胚胎微环境对肿瘤细胞的抑制作用有关。(3)孕11、13、15、17天的小鼠羊水能抑制H22细胞增殖,诱导其凋亡,可能与PCNA和P53的表达有关,并孕期越早、干预时间越长,效果越显著。