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目的筛选并分析间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)经5-氮杂胞苷(5-azacytidine,5-azaC)诱导分化为心肌样细胞过程中组蛋白乙酰化酶GCN5招募促分化相关蛋白集合体的组成,明确MSCs分化为心肌样细胞过程中与GCN5活性相关的转导途径和转录调控网络,为进一步剖析MSCs分化为心肌样细胞过程中的分化调控机制,提高间充质干细胞的分化率及其临床应用提供理论依据。方法1.鉴定MSCs经5-azaC诱导分化为心肌样细胞。免疫荧光细胞化学检测心肌细胞结构和功能蛋白cTnt、MHC和Cx43的表达,实时荧光定量PCR检测心肌特异性基因GATA4、MEF2C的时序性表达。2.免疫荧光细胞化学检测GCN5在细胞中的定位,Western印迹检测GCN5的时序性表达量以确定免疫共沉淀核蛋白提取时间。3.免疫共沉淀技术Co-IP沉淀与GCN5结合的蛋白,再经过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离、最后利用高效液相色谱芯片纳流电喷雾串联质谱联用技术(HPLC-CHIP-NanoSpray-ESI-MS/MS)鉴定与GCN5结合的蛋白。4.利用ExpAsy、EMBL-EBI和Intact数据库对上述质谱结果进行生物信息学分析,分别从心肌样细胞及干细胞分化角度筛选相关蛋白因子。5.验证实验包括:(1)蛋白组免疫印迹验证部分心肌分化相关蛋白;(2)MTT法、流式细胞术验证与MSCs细胞周期和细胞增殖相关的因子。6.实时荧光定量PCR筛选GCN5蛋白复合体调控的细胞周期相关的基因。CHIP技术检测该基因启动子区域的乙酰化水平,进而探讨GCN5调控MSCs经5-azaC诱导后的干细胞周期和增殖特性。结果1. MSCs经5-azaC诱导后,形态出现心肌样细胞改变,心肌特异性基因、心肌结构和功能蛋白较诱导前表达明显增加,表明5-azaC能够诱导MSCs分化成心肌样细胞。2.免疫细胞荧光结果表明,诱导组和未诱导组GCN5表达位置始终在胞核;Western blotting结果表明,诱导组和未诱导组组间和组内各时段的平均GCN5蛋白表达量差异无统计学意义(P>0.05)。3.免疫共沉淀技术可行性分析表明,阳性对照组有GCN5蛋白表达,实验组有GCN5蛋白表达,对照组无GCN5蛋白表达,免疫共沉淀技术可行,对照组起到了排除非特异性干扰的作用;实验组排除非特异性结合后的条带为质谱分析条带,利用HPLC-CHIP-NanoSpray-ESI-MS/MS鉴定质谱分析的条带,质谱结果用Agilent Technologies公司的Spectrum Mill MS Proteomics Workbench软件分析。4.通过Co-IP-SDS-PAGE-MS/MS鉴定和生物信息学分析获得GCN5复合体组分为(1)分化相关的蛋白:DNA结合蛋白Sp1/KLF、转录辅激活子PGC-1α和Rb1、转录延伸复合体组成成分以及信号通路蛋白Akt;(2)与周期和增殖相关的蛋白因子:依赖ATP的染色质重塑复合体成分Arid1b和Smarca5、转录起始复合体成分BRF1、转录因子Sox9和Erf、锌指结构蛋白Zfml等。5.验证实验结果:(1)蛋白组免疫印迹验证部分心肌分化相关蛋白,4个结合分析显示IP-MS/MS方案筛选结合蛋白的有效性;(2)MTT法、流式细胞术现象表明,MSCs经5-azaC诱导3 d后G0/G1期细胞比例达最高,此后逐渐降低,细胞增殖指数(proliferation index, PI)及G2/S期细胞比例与上述结果相反;上述结果从现象上反映了GCN5复合体中周期和增殖相关蛋白因子的生物学功能。6. P21、P53、Sox9基因时序性表达实验表明,P21是GCN5蛋白复合体调控的细胞周期相关的基因,诱导组GCN5与P21基因启动子区域结合能力及P21基因启动子区域组蛋白H3乙酰化水平高于未诱导组。结论1. Co-IP-SDS-PAGE-MS/MS鉴定和生物信息学分析获得GCN5复合体,验证了GCN5募集蛋白复合体具有调控干细胞分化、细胞周期和增殖的生物学功能。2. GCN5募集蛋白复合体通过细胞周期和增殖相关基因P21调控MSC的心肌样分化。明确了MSCs分化为心肌样细胞过程中与GCN5活性相关的转导途径和转录调控网络,为提高间充质干细胞的分化率及其临床应用提供理论依据。