前言　　系统性红斑狼疮(Systemiclupuserythematosus，SLE)是典型的全身性自身免疫性疾病，其发病及疾病严重程度与遗传因素有关。免疫学异常是本病发生的关键，涉及几乎所有单个核细胞及众多细胞因子。许多证据表明白细胞介素-10(Interleukin-10，IL-10)在SLE发病中起重要作用，其机制可能与IL-10参与造成免疫失调及丧失自身耐受，促进自身抗体的形成并介导器官损伤有关。　　IL-10作为一种抑制性细胞因子可以由多种细胞产生，近期有研究指出调节性T淋巴细胞(Treg)和调节性B淋巴细胞(Breg)是体内IL-10的主要来源。与其他细胞因子一样，IL-10要与细胞膜表面的IL-10受体结合才能发挥作用。人类和小鼠的IL-10受体由两个亚单位组成——IL-10R1和IL-10R2，属于干扰素受体家族成员。IL-10R2早先被认为是IFNR的组成部分不与IL-10发生结合，只起到激发细胞内转导信号的作用。IL-10R1是IL-10受体中与IL-10结合的亚单位，IL-10与IL-10R1结合后经Jak-stat信号转导系统向细胞内传递兴奋性或抑制性信号，并且有人指出IL-10R1胞浆端产生的功能呈区段分布。我们在对NZW小鼠IL-10R1基因编码区序列进行的DNA序列分析显示，与C57BL/6小鼠比较NZW小鼠的IL-10R1编码区共有18处碱基置换，其中7处碱基置换将导致编码氨基酸的改变，最重要的一点是:NZW小鼠IL10R1基因第1146号碱基由鸟嘌呤核苷酸替换为腺嘌呤核苷酸(G1146A)，导致编码氨基酸由甘氨酸置换为谷氨酸(G356E)，经Genedoc软件模拟分析显示，该编码氨基酸改变将导致IL-10R1基因酪氨酸激酶Jak1和Tyk2磷酸化结合模序缺失。需要特别提出的是G356E位于IL-10R1细胞内298-405区，这一区域负责IL-10信号转导的负向调节。同时我们也惊奇地发现另一种典型的SLE模型小鼠MRL的IL10R1基因型与NZW小鼠相同，这提示我们IL-10R1基因的异常导致功能改变引起SLE发病。T淋巴细胞是免疫系统中很重要的组成细胞，并且在免疫应答中起到很重要的作用，T淋巴细胞在包括自身抗体产生、自身免疫细胞分化增殖以及免疫耐受失调等多方面参与SLE的发病及进展虽然小鼠T淋巴细胞不表达IL-10R1，但有人发现小鼠CD8+T淋巴细胞在接受刺激后IL-10R1有短暂表达。这一点提示我们只有活化后的T淋巴细胞才接受Tr1细胞和Breg细胞产生的IL-10的调节作用。　　本课题拟以我们独特的前期工作结果为基础，主要是构建野生型、NZW型和G1146A单碱基突变型IL-10R1载体，并将其转染至BA/F3细胞稳定表达，针对这种独特的NZW型IL-10R1信号转导机制及其对小鼠B淋巴细胞功能的影响进行研究，同时也进一步阐明IL-10通过IL-10R1对小鼠CD4+T淋巴细胞进行调控的时机。进一步探讨SLE发病和进展机制，从而寻找新的治疗靶点。　　实验方法　　1.取C57BL/6小鼠脾细胞，提取totalRNA后，采用设计好的引物反转录并扩增出野生型IL-10R1基因，测序后与GeneBank里的IL-10R1基因进行比对，发现1703位点出现有义突变，做单碱基突变修复后，克隆至pcDNA3.1(+)载体中构建成pcDNA3.1(+)WILD-IL-10R1。在pcDNA3.1(+)WILD-IL-10R1的基础上采用PCR的方法诱导18处位点的突变，测序后与NZW型IL-10R1基因一致，构建成pcDNA3.1(+)NZW-IL-10R1。在pcDNA3.1(+)WILD-IL-10R1的基础上采用PCR的方法诱导G1146A突变，测序后确定准确无误，构建成pcDNA3.1(+)G1146A-IL-10R1。将上述三种载体菌保扩大培养后，提取无内毒素载体，-20℃冻存备用。　　2.将pcDNA3.1(+)WILD-IL-10R1、pcDNA3.1(+)NZW-IL-10R1和pcDNA3.1(+)G1146A-IL-10R1三种载体分别转染至BA/F3细胞中，G418筛选后，取稳定表达并表达水平相似的细胞株扩增培养。采用MTT法检测三组细胞接受IL-10刺激后增殖情况，并绘制增殖曲线。采用流式细胞术检测三组细胞接受IL-10刺激后CD32和LECAM-1表达情况。采用免疫印记法检测三组细胞接受IL-10刺激前后Jak1、stat3、Tyk2、p-Jak1、p-stat3和p-Tyk2表达情况。　　3.取C57BL/6小鼠脾细胞，将其通过T细胞尼龙毛柱除去B淋巴细胞，然后无菌条件下通过流式细胞仪分选出CD4+T淋巴细胞，加入anti-CD3和anti-CD28刺激分选后的CD4+T淋巴细胞，并于0h、12h、24h、46h、72h时检测细胞表面IL-10R1表达水平，并相互比较。　　实验结果　　1.构建的pcDNA3.1(+)WILD-IL-10R1、pcDNA3.1(+)NZW-IL-10R1和pcDNA3.1(+)G1146A-IL-10R1三种载体经过测序符合要求。　　2.表达NZW-IL-10R1的B细胞的增殖能力随着IL-10的浓度增加和时间延长而递增，而表达WILD-IL-10R1的B细胞却递减;　　3.接受IL-10刺激后表达NZW-IL-10R1的B细胞CD16/32表达水平较表达WILD-IL-10R1的B细胞低，LECAM-1表达水平却较表达WILD-IL-10R1的B细胞高;　　4.接受IL-10刺激前后表达NZW-IL-10R1和表达WILD-IL-10R1的B细胞Jak1、stat3和Tyk2水平相近，但接受IL-10刺激后表达NZW-IL-10R1的B细胞Jak1和stat3磷酸化水平较表达WILD-IL-10R1的B细胞明显降低，而Tyk2磷酸化水平却无明显变化;　　5.未刺激小鼠CD4+T淋巴细胞不表达IL-10R1，随着刺激时间的延长IL-10R1表达增加，24h时达到最高，随后表达水平开始下降，72h时表达情况与未刺激时基本相同。　　结论　　1.pcDNA3.1(+)WILD-IL-10R1、pcDNA3.1(+)NZW-IL-10R1和pcDNA3.1(+)G1146A-IL-10R1三种载体符合实验要求;　　2.NZW型IL-10R1因JAK1-STAT3信号转导通路障碍丧失了对B细胞活化与增殖以及趋向性迁移的抑制作用，与系统性红斑狼疮的发生及发展有关;　　3.作为外周耐受的重要细胞因子，IL-10通过NZW型IL-10R1对小鼠CD4+T淋巴细胞的影响就是在IL-10R1短暂表达的这一段时间内，这为我们探讨NZW型IL-10R1对CD4+T淋巴细胞的影响提供了有力支持，为研究系统性红斑狼疮发生和发展机制指明了一个新的研究方向。