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猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是严重危害全球养猪业的重要病原之一。PRRSV感染以母猪繁殖障碍和生长猪的呼吸道疾病为特征,并可导致免疫抑制和细菌继发感染。因此,研究PRRSV诱导的免疫抑制和细菌继发感染的相关机制对于阐明其致病机理具有重要的科学意义。Th17细胞在抗菌感染免疫应答、自身免疫以及肿瘤疾病中发挥重要作用,本研究首先采用ELISA检测了不同致病性PRRSV毒株感染PAMs后Th17细胞分化相关细胞因子表达的变化,然后分析了不同致病性PRRSV毒株感染对Th17细胞应答的影响,最后应用感染性克隆和慢病毒包装技术分析了IL-17A对PRRSV体外增殖的影响,以期为解析PRRSV的免疫抑制及其与细菌继发感染的机制提供科学依据。采用ELISA方法检测了高致病性PRRSV毒株(JXwn06)和低致病性PRRSV毒株(HB-1/3.9)感染PAMs上清中IL-6和TGF-β的表达水平。结果表明, PRRSV感染抑制PAMs表达IL-6、TGF-β,且高致病性PRRSV感染对PAMs表达IL-6的抑制效应强于低致病性PRRSV,提示PRRSV感染可抑制PAMs表达Th17细胞分化相关细胞因子IL-6和TGF-β。将JXwn06与HB-1/3.9经滴鼻感染仔猪,采用流式细胞术分析感染后不同时间点PBMCs中T细胞亚群变化。结果显示,JXwn06感染组外周血CD3+CD4+T和CD3+CD8+T细胞的比例和绝对数量均显著降低,同时CD4+IL-17A+Th17的比率显著低于HB-1/3.9感染组和对照组(p<0.05)。采用免疫组化染色方法对PRRSV感染猪不同组织中Th17细胞进行计数。结果显示,JXwn06感染组在感染后不同时间点肺脏中Th17细胞的数量均显著降低(p<0.001),而脾脏和腹股沟淋巴结中则无显著差异。肺脏细菌计数表明,JXwn06感染猪肺脏中细菌载量显著高于HB-1/3.9感染组和对照组。以上结果表明,高致病性PRRSV感染不仅可抑制猪外周血中Th17细胞应答,同时可导致猪肺脏中Th17细胞数量下降,且感染猪肺脏中细菌载量升高,提示感染猪的细菌继发感染与Th17细胞应答的抑制可能有密切的关系。利用高致病性PRRSV毒株JXwn06的感染性cDNA克隆,成功构建并拯救四株可表达外源IL-17A的嵌合病毒。嵌合病毒的TICD50测定结果发现,RvJX-IL17A-R1的滴度随传代次数增加而逐渐降低,而另外三个拯救病毒仅第二代的滴度下降。对嵌合病毒进行序列分析发现,RvJX-IL17A-R2、RvJX-IL 17A-HA-R1和RvJX-IL17A-HA-R2的第三代病毒基因组中插入的IL-17A基因均有两个碱基突变,导致相应的氨基酸位点发生变异。嵌合病毒的增殖动态分析表明IL-17A基因的表达可抑制病毒的增殖。用灭活的RvJX-IL17A-R1感染细胞上清液处理MARC-145细胞,表明对JXwn06的增殖具有抑制效应。利用IL-17A慢病毒系统转导MARC-145细胞,以JXwn06(MOI=0.1)感染转导细胞,于不同时间点收取病毒液进行滴度测定。结果表明,表达1L-17A的慢病毒转导组病毒滴度显著低于pWPXL-GFP慢病毒转导组和正常细胞对照组(p<0.001),表明过表达IL-17A对JXwn06在MARC-145细胞上的增殖有抑制效应。双荧光素酶报告试验表明,IL-17A可上调ISRE和NF-κB启动子活性,而对IFN-β启动子活性无显著影响；Western blotting分析结果表明,在病毒感染的MARC-145细胞中,IL-17A可上调抗病毒蛋白PKR的表达。综上所述,我们的研究结果表明,(ⅰ)高致病性PRRSV感染可抑制猪外周血中Th17细胞应答,并可导致猪肺脏中Th17细胞数量下降；(ⅱ)高致病性PRRSV感染猪肺脏中细菌载量升高,提示感染猪的细菌继发感染与Th17细胞应答的抑制可能有密切的关系；(ⅲ)IL-17A对PRRSV体外增殖具有抑制效应。