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目的:探究德国K5M眼表分析仪用于干眼泪膜分度诊断的诊断价值,并以此为基础研究干眼临床常见中医证型与K5M眼表检查结果及危险因素的相关性,总结干眼临床常见中医证型的眼表检查及危险因素的规律性。总结左韬教授运用杞参方论治“气阴两虚证”干眼的经验。基于网络药理学及生物信息学的研究思路,探究杞参方治疗干眼的分子网络调控机制,筛选出杞参方治疗干眼的主要成分、作用靶点、生物过程、信号通路等。基于中药网络药理学筛选出的主要信号通路,通过体内、体外实验研究杞参方对高渗诱导的干眼模型的保护作用。方法:1.收集门诊干眼患者35例,再随机抽取35例非干眼者,通过K5M眼表分析仪采集即时眼表参数,包括NI BUT f、NI BUT av、TMH,进行K5M眼表分析仪与常规眼表检查对干眼泪膜相关指标分度的诊断效能试验。2.收集门诊干眼患者160例,采集患者基本信息、危险因素情况、OSDI评分;判定中医证型,使用K5M眼表分析仪采集TMH、NIBUT f、NIBUT av、睑板腺缺失情况评分、睑板腺堵塞情况、眼红指数、脂质情况,进行干眼临床常见中医证型与K5M眼表检查结果及危险因素的相关性分析。3.（1）在TCMSP数据库中检索杞参方中14味中药的主要活性成分及作用靶点。（2）应用Cytoscape 3.8.0软件构建杞参方入血活性成分-靶点网络图;（3）通过Gene Cards、Dis Ge Net、Human Phenotype Ontology、OMIM四大疾病数据库检索当前已知的与干眼发病明确相关的靶点。（4）通过bioinformatics在线工具筛选杞参方有效成分作用靶点与干眼差异基因的交集基因及对应的药物有效成分;并运用STRING数据库对交集靶点基因进行PPI网络构建,运用Cytoscape3.8.0筛选核心网络。（5）通过Metascape数据库对杞参方作用于干眼的交集基因进行GO富集分析及KEGG调控通路富集分析。4.取60只SPF级BALB/c小鼠,采用随机数字表法将小鼠随机分为6组,分别为:空白组（BC组）,模型组（HO组）,西药组（HO+SH组）,杞参方颗粒高、中、低剂量组（HO+HD组、HO+MD组、HO+LD组）,每组10只。除BC组外,其余各组小鼠使用高渗盐水建立干眼小鼠模型。14d后进行模型评价,剔除不符合成模标准的小鼠。HO组继续点眼,方法同前,维持干眼状态;HO+SH组给予高渗盐水联合0.3%玻璃酸钠滴眼液点眼;HO+HD组、HO+MD组、HO+LD组分别给予高渗盐水点眼联合杞参方高、中、低剂量灌胃,每日一次。所有干预因素均连续施加14d。末次干预后2h,测定SⅠT、BUT及FL。进HE染色观察角膜层间结构;透射电镜观察角膜上皮细胞超微结构;TUNEL法检测角膜细胞凋亡;ELISA法检测泪液炎性因子IL—lβ、IL-6、IL-8、TNF-α的表达情况;IHC法检测小鼠角膜组织中凋亡因子caspase-1、caspase-3及AQP5、JNK、p-JNK、p38MAPK、p-p38MAPK、ERK、p-ERK的表达;WB法检测角膜组织中AQP5、JNK、p-JNK、p38MAPK、p-p38MAPK、ERK、p-ERK蛋白表达水平。5.通过500m Osm/L浓度渗透压作用于HCECs制造干眼细胞模型,将空白血清、玻璃酸钠滴眼液、杞参方颗粒高、中、低剂量的含药血清作用于已造模的干眼HCECs,CCK-8法检测不同药物刺激对HCECs存活率的影响;ELISA法检测细胞外液炎性因子IL—lβ、IL-6、IL-8、TNF-α的表达情况;ICC法检测凋亡因子caspase 1、caspase 3及AQP5的表达变化;WB检测HCECs的AQP5、JNK、p-JNK、p38MAPK、p-p38MAPK、ERK、p-ERK表达情况。结果:1.K5M眼表分析仪对干眼组与非干眼组组间NIBUT f、NIBUT av、TMH比较,差异有统计学意义（P<0.05）。NIBUT f与BUT、NIBUT av与BUT、TMH与SⅠT的相关系数r分别为0.675、0.809、0.711,且在置信度（双测）为0.01时,相关性是显著的。K5M眼表分析仪的NIBUT f与常规检查诊断BUT的符合率为76.81%,ROC曲线下面积为0.838,标准误为0.036,P<0.01,95%置信区间为（0.767,0.908）;NIBUT av与BUT的符合率为76.09%,ROC曲线下面积为0.903,标准误为0.027,P<0.01,95%置信区间为（0.851,0.955）;TMH与SⅠT的符合率为92.75%,ROC曲线下面积为0.712,标准误为0.043,P<0.01,95%置信区间为（0.628,0.796）。2.（1）不同中医证型干眼患者的生物学指标分布比较:证型人数占比由高到低为:气阴两虚证>肺阴不足证>肝经郁热证>邪热留恋证。不同证型组间性别、病程比较,差异有统计学意义（P<0.05）;而不同证型组间年龄差异比较,无统计学意义（P>0.05）。（2）肺阴不足证的患者合并其他部位干燥、眼睛环境敏感、免疫系统疾病史的风险因素占比高于其他证型。肝经郁热证的患者睡眠不佳、眼药水滥用、长期用药史的风险因素占比高于其他证型。气阴两虚证的每日平均视屏终端使用时间超过5小时、糖尿病病史、角膜屈光手术史或白内障手术史的风险因素占比高于其他证型。邪热留恋证的配戴隐形眼镜、过敏性眼病史的风险因素占比高于其他证型。（3）不同中医证型与OSDI评分、NIBUT f、NIBUT av、TMH、睑板腺缺失、睑板腺开口堵塞情况、眼红指数、脂质情况分度进行相关性分析,差异有统计学意义（P<0.05）。3.筛选出杞参方活性成分127个,中药-活性成分关系217个,共得到335个作用靶点,1292种成分-靶点关系。其中作用靶点最多的3个成分依次为槲皮素、鲁期可皂甙元、山柰酚,效应靶点分别为254、84、65个。四大疾病数据库检索当前已知的与干眼发病明确相关的靶点共计3549个。取交集后得到杞参方治疗干眼的211个靶点基因;采用网络拓扑参数进行核心网络筛选,获得AKT1、IL6、VEGFA、TP53、TNF、CASP3等15个关键靶点基因。GO富集分析结果显示,生物过程方面,主要包括了血液循环、细胞因子介导的信号通路、活性氧代谢过程、MAPK级联通路的正调节、细胞增殖负调控、凋亡信号通路等生物过程。KEGG信号通路富集后,与干眼相关的主要包括糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、MAPK信号通路、凋亡、上皮细胞信号转导等。4.给药干预后,所有组间小鼠干眼评价指标SⅠT、BUT、FL进行one-way ANOVA比较,差异均有显著统计学意义（P<0.01）。HE染色:BC组角膜上皮细胞形态正常,排列整齐,上皮完整连续。基底层细胞排列紧密,分布整齐;HO组及各治疗组角膜上皮均存在不同程度表层细胞丝状分离,角膜上皮细胞排列紊乱,伴有表层上皮细胞损伤、脱落,角膜表面欠光滑,角膜基质细胞排列无序,胞核固缩。其中HO+HD组要好于HO+MD组,其次依次为HO+SH组、HO+LD组、HO组。电镜:BC组角膜上皮细胞向外伸出丰富的微绒毛,呈指状突起,排列整齐规则;HO组角膜上皮微绒毛可见明显减少,微绒毛形态也与BC组有很大差别,偶见指状突起,大部分微绒毛变短,可见脱落,上皮细胞排列紊乱;杞参方各治疗组微绒毛数量多于HO组,形态较HO组排列规则、整齐;HO+SH组微绒毛数量略多于HO组,形态较HO组排列规则、整齐,但整体差于杞参方各治疗组。角膜细胞凋亡结果显示所有组间one-way ANOVA比较差异有显著统计学意义（P<0.01）。ELISA法检测泪液炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α的所有组间one-way ANOVA比较差异均有显著统计学意义（P<0.01）。IHC检测小鼠角膜组织中凋亡因子caspase-1、caspase-3和AQP5、JNK、p-JNK、p38MAPK、p-p38MAPK、ERK、p-ERK的蛋白表达水平one-way ANOVA比较,差异均有显著统计学意义（P<0.01）;而JNK、p38、ERK蛋白表达所有组间one-way ANOVA比较,差异无统计学意义（P>0.05）。WB法检测角膜组织中;WB法检测角膜组织中AQP 5、p-JNK、p-p38MAPK、p-ERK所有组间one-way ANOVA比较,差异均有显著统计学意义（P<0.01）;而JNK、p38MAPK、ERK所有组间one-way ANOVA比较,差异均无统计学意义（P>0.05）。5.CCK-8法检测不同药物对HCECs存活率所有组间one-way ANOVA比较差异有显著统计学意义（P<0.01）。ELISA法检测细胞外液炎症因子IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α的所有组间one-way ANOVA比较,差异均有显著统计学意义（P<0.01）。ICC检测不同给药后的HCECs的凋亡因子caspase-1、caspase-3及AQP5的表达的one-way ANOVA比较差异均有显著统计学意义（P<0.01）。WB法检测不同干预后的HCECs的AQP 5、p-JNK、p-p38MAPK、p-ERK蛋白表达所有组间one-way ANOVA比较,差异均有显著统计学意义（P<0.01）;而JNK、p38MAPK、ERK所有组间one-way ANOVA比较,差异均无统计学意义（P>0.05）。结论:1.K5M眼表分析仪用于干眼的单一泪膜指标分度诊断时,能够为临床应用于分度诊断及疗效评价提供准确可靠的价值。2.干眼患者的风险因素情况、OSDI评分及K5M眼表分析仪检查结果情况能够为干眼的中医辨证的客观化提供一定的辅助参考依据。3.杞参方可能通过降低炎症反应和免疫应答,改善血液循环及氧代谢,抑制细胞凋亡等多途径共同发挥治疗干眼的调控作用,其中以调控MAPK信号通路、细胞凋亡等途径最为明显。4.杞参方可有效改善高渗诱导小鼠干眼模型的SⅠT、BUT、FL、角膜上皮形态及角膜上皮细胞微绒毛形态,降低泪液炎症因子IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α,减少角膜组织JNK、p38MAPK、ERK的磷酸化和凋亡因子caspase-1、caspase-3及AQP5的蛋白表达,最终抑制炎症反应和细胞凋亡,减轻角膜上皮细胞损伤。5.杞参方可有效提高500 m Osm高渗诱导HCECs干眼模型的细胞存活率,降低细胞外液炎症因子IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α,减少HCECs的JNK、p38MAPK、ERK的磷酸化和凋亡因子caspase-1、caspase-3及AQP5的蛋白表达,最终抑制炎症反应和细胞凋亡。