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草菇是一种在热带和亚热带地区大规模栽培的食用菌,并且具有很高的食药用价值。但是,草菇栽培具有很强的季节性,草菇采后易开伞以及低温自溶等问题都妨碍了草菇的生产。而且,对草菇子实体形成以及发育的研究进展缓慢。近年来,随着草菇基因组的公布,对其功能基因组的研究也逐步展开,这将会对草菇的生产栽培起到助推作用。基于本实验室的草菇基因组、转录组数据结合粗糙脉孢菌的相关研究,筛选得到了一个可能与草菇子实体形成发育相关的基因vv-rcd1。对该基因的结构和表达量进行了分析后,构建了 RNAi和过量表达载体,通过农杆菌介导转化得到草菇转化子,并对草菇转化子进行了初步研究。主要试验结果如下:(1)rcd1在草菇中的同源基因为GME4331,命名为vv-rcd1。该基因全长1648 bp,3’UTR长12 bp,5’UTR长288 bp,编码区1348 bp;编码区含有6个外显子,5个内含子;是RCD1蛋白家族成员,含有Armadillo-type fold结构域。(2)粗糙脉孢菌、裂殖酵母、水稻、小鼠、人类、斑马鱼、果蝇、拟南芥、线虫和酿酒酵母这10种模式生物的RCD1类似蛋白与草菇RCD1蛋白具有较高的相似性,一致性为54.42%,其中粗糙脉孢菌的最高,为61.28%。而且,草菇RCD1与10种模式生物都含有相同的5种基序。这表明RCD1蛋白在真核生物界具有很高的保守性。系统进化分析结果显示:虽然RCD1普遍存在于食药用真菌,但亲缘关系较远的真菌其rcd1基因功能差异也应该比较大。(3)草菇PYd15、PYd21和H1521菌丝体、原基、纽扣期菌柄、蛋形期菌柄、伸长期菌柄和成熟期菌柄八个样品总RNA的数字基因表达谱(DGE)tag定位分析vv-rcd1表达量,和草菇H1521菌丝体、子实体原基、纽扣期、蛋形期菌柄、蛋形期菌盖、伸长期菌柄、伸长期菌盖、成熟期菌柄和成熟期菌盖九个样品总RNA荧光定量PCR分析vv-rcd1表达量,结果表明:vv-rcd1基因可能在草菇蛋形期,尤其是草菇蛋形期菌盖的初始分化与生长方面起作用。(4)农杆菌菌液PCR、目的质粒双酶切和测序结果显示:草菇GME4331基因的RNAi正、反向以及成环片段和过量表达全长序列成功地插入到了pBHg-gpd表达载体中,并分别成功获得了含有rcd1-RNAi和rcd1-过量表达载体的农杆菌工程菌株。(5)拟转化子经过两轮的潮霉素抗性筛选,两轮的潮霉素磷酸转移酶(hpt)基因的稳定性验证,得到hpt稳定遗传的GME4331OE拟转化子4个,GME4331RNAi拟转化子3个。荧光定量PCR结果显示:与野生型草菇H1521相比,草菇vv-rcd1RNAi干扰拟转化子4il-2,4i12-1和4i24.2的rcd1基因表达量分别下调3.41、5.14和1.56倍;草菇vv-rcd1 OE过量表达转化子4010、405-2和4022的rcd1基因表达量分别上调1.84、1.20和1.15倍。rcd1-RNAi和rcd1-过量表达转化子的获得表明农杆菌介导的草菇遗传转化体系初步建立。(6)转化子的生物学特性观察表明:vv-rcd1基因可能跟草菇菌丝生长速度无明显关系。rcd1基因的过量表达可能导致草菇更早地产生更多的厚垣孢子以及加速菌丝的衰老,这似乎也暗示rcd1过量表达转化子菌丝适应外界环境的能力变弱了。本研究对筛选到的vv-rcd1基因进行了结构、表达量的分析,并初步建立了草菇遗传转化方法。结合RNAi和过量表达实验初步探究了 vv-rcd1基因在草菇子实体形成和发育过程中的作用。