研究背景和目的流行性乙型脑炎(Japanese encephalitis B,JE,简称乙脑)也称日本脑炎,是由流行性乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV,简称乙脑病毒)引起,经蚊传播的人畜共患的中枢神经系统急性传染病。乙脑病毒是热带和亚热带地区最普遍的节肢动物媒介病毒之一,属于黄病毒科,黄病毒属病毒,为单股正链RNA病毒,RNA大小约为11kb,含有一个长的开放阅读框架(ORF)编码3个结构蛋白(C蛋白、PrM/M蛋白、E蛋白)和7个非结构蛋白(NS1、NS2a、NS2b、NS3、NS4a、NS4b和NS5),分五个基因型,一个血清型。乙脑流行于亚洲东部、南部及太平洋沿岸,全球每年大约有35000～50000例病例,其中约10000～15000例死亡。乙脑的受害者大多是儿童,约50%的幸存者有神经系统后遗症。乙脑在世界许多国家均有流行,我国是高发地区,全国除了青海以外的省市均有乙脑病例的报道,局部地区有爆发或者流行。乙脑病毒的动物储存宿主主要是猪和鸟。蝙蝠已经被认识到是一种重要的病毒储存宿主。中国和日本的一些研究表明在蝙蝠体内能检测到乙脑病毒或乙脑病毒的血清抗体。中国学者有从蝙蝠体内分离出乙型脑炎病毒的报道。近年来,中国云南省的4株乙脑病毒蝙蝠分离株(B58、GB30、HB49和HN97)的基因组序列已被确认,这4株乙脑病毒蝙蝠分离株均属于GⅢ型。然而,蝙蝠在人畜乙脑传播中的作用尚不清楚。鉴于乙脑病毒的基因型有一定的地区和时间分布特征,对蝙蝠乙脑病毒株的基因型以及其与人、猪、蚊分离株的基因同源性进行分析,可有助于探讨蝙蝠在乙脑病毒传播中的作用。本研究中,我们对本实验室采集自中国广东、海南、湖南的普通长翼蝠、小黄蝠、中华菊头蝠、大足鼠耳蝠这4个蝙蝠种的9份可疑乙脑病毒阳性标本进行了乙脑病毒分离、鉴定以及基因组序列的确定及分析。同时,我们从GenBank中选取了代表不同时间、地域、宿主的其他乙脑病毒株,包括23个乙脑病毒基因组全序列、12个E蛋白的基因序列、6个M蛋白的基因序列及1个NS5蛋白的基因序列,与我们的分离株一起进行基因序列的比较和分析。本研究目的是通过上述分析,初步阐明蝙蝠在乙脑病毒传播的作用。研究方法1蝙蝠乙脑病毒株的分离单层BHK-21细胞接种9份可疑蝙蝠乙脑病毒阳性标本(GD1、HN1、HN2、HN3、YY1、YY2、YY3、SY87、YY158),持续观察7天,并设本实验室保存的中山株(Nakayama)为阳性对照,正常细胞为空白对照。7天后收取细胞病毒液,于-80℃冰箱中冻存。每组5只2～3日龄NIH乳鼠分别经颅接种0.02ml可疑蝙蝠乙脑病毒阳性标本(GD1、HN1、HN2、HN3、YY1、YY2、YY3、SY87、YY158),设Nakayama株作阳性对照,阴性对照接种DEPC水。观察记录乳鼠是否出现拒乳、弓背、行动迟缓、侧卧、抽搐、嗜睡、偏瘫等症状以及死亡情况。接种后24h内每2h观察1次,24h后一天观察3次,持续14天。无菌操作解剖乳鼠取脑组织保存于RNAlater,置于-80℃冰箱。2蝙蝠乙脑病毒株的鉴定2.1蝙蝠乙脑病毒特异性核酸的检测将染毒BHK-21细胞悬液和染毒乳鼠脑组织进行RNA提取、逆转录、PCR,可疑阳性PCR产物送公司测全序。2.2蝙蝠乙脑病毒滴度的测定采用毒力稳定的第三代盲传病毒细胞液,用细胞全培液将病毒液作连续10倍的稀释从10-1到10-8,每一稀释度接种8孔,设阳性对照和空白对照。显微镜下观察记录病变孔数。采用Reed-Muench法计算TCID50。2.3间接免疫荧光参照文献以及抗体试剂盒说明书(Abcam)选择抗体工作浓度进行检测。2.4蝙蝠乙脑病毒半数致死量(LD50)的测定乳鼠以窝为单位分成12组,每组5～6只,采用经颅接种0.02ml的方式。一组为阳性对照组接种中山株(Nakayama),一组为阴性对照组接种5%MEM细胞培养液,另外十组分别接种GD1和HN2株10-0～10-4的病毒液。观察记录死亡情况,采用改良寇氏法计算半数致死量。取10-2组死亡鼠脑进行RNA的提取,RT-PCR检测乙脑病毒E基因的目的片段。2.5病理组织观察10-0GD1、10-0HN2组、阳性对照组和阴性对照组乳鼠死亡后立即取脑保存于10%福尔马林中,制成石蜡切片进行观察。3蝙蝠乙脑病毒株基因组的分析根据分离的国家、年份、宿主从Genbank中选出23个乙脑病毒基因组序列、12个E蛋白的基因序列、6个M蛋白的基因序列及1个NS5蛋白的基因序列作为比较的基因序列。采用MEGA4.0软件进行多序列比对。采用MegAlign软件对核苷酸的相似性、氨基酸序列的相似性进行计算。采用DNAMAN软件预测RNA二级结构。采用Geneious 5.5.6显示基因序列的差别。本研究分别以JEV的E蛋白、M蛋白、NS5蛋白的核苷酸序列构建进化树,以West Nile Virus作为树根。利用MEGE4.0软件,采用neighbor-joining法构建系统进化树,使用Maximum Composite Likelihood法评估,所得的树用Bootstrap(1000 replicates)法进行检验。4质量控制1)移液枪头、冻存管、EP管等实验耗材均为一次性用品;2)RNA提取和逆转录实验所采用的所有容器和配制试剂用DEPC水处理,高温高压处理,烘干待用,以去除RNA酶污染;3)全程戴口罩、手套、帽子,在无菌室生物安全柜进行操作,防止试剂和实验过程受到污染;4)实验过程严格设立阳性对照、阴性对照和空白对照;5)细胞培养过程所有操作均在细胞培养间生物安全Ⅱ级超净台进行操作,防止污染;6)在配置PCR反应体系时要特别小心操作,防止交叉污染。研究结果1.蝙蝠乙脑病毒株的分离空白对照BHK-21细胞一直呈梭形生长,阳性对照细胞于第三天开始出现CPE,细胞陆续变圆脱落。接种可疑JEV的细胞个别有变圆脱落,但是病变没有阳性对照明显。盲传三代后均有病变,但仅GD1、HN2株出现和阳性对照类似的细胞病变。阳性对照组乳鼠2～5日内出现体重减轻、拒乳、颈项强直、弓背、行动迟缓、侧卧、抽搐、偏瘫、嗜睡等症状。实验组乳鼠接种1～7日后每组均有个别出现与阳性对照组类似的症状。阴性对照组无一例病变,观察14天后仍健康。2.蝙蝠乙脑病毒株的鉴定2.1蝙蝠乙脑病毒特异性核酸的检测接种可疑蝙蝠乙脑病毒株的BHK-21细胞仅GD1、HN2株检测到可疑阳性PCR产物。接种可疑蝙蝠乙脑病毒株的乳鼠脑组织中并没有检测到可疑阳性PCR产物。2.2蝙蝠乙脑病毒滴度的测定Reed-Muench法计算GD1的病毒滴度是5.48TCID50/ml,HN2的病毒滴度是5.98TCID50/ml。2.3间接免疫荧光GD1、HN2株均有和阳性对照类似的绿色荧光。空白对照不见荧光,有极弱的背景光。2.4蝙蝠乙脑病毒半数致死量(LD50)的测定改良寇氏法计算得 GD1 LD50=4.28TCID50(95%CI,4.03,4.53)/0.02ml;HN2LD50=4.51TCID50(95%CI,4.34,4.68)/0.02ml。取 10-2 组死亡乳鼠脑组织标本,经乙脑病毒E基因检测发现,出现目的条带的率为100%,经测序后确定为乙脑基因。2.5病理观察GD1和HN2株死亡乳鼠脑病理切片显示脑血管扩张、充血、出血、血栓形成,脑细胞点状坏死,炎症细胞渗出浸润等现象。阳性对照组的病变特征更明显,阴性对照无任何病理现象。3.蝙蝠乙脑病毒株基因组的分析以及与其他来源乙脑病毒株的比较GD1和HN2的基因组相似性是99.9%,与其他四株蝙蝠乙脑病毒分离株(GB30、B58、HB49和HB97)的相似性是99.4%～99.6%,与其他乙脑病毒基因组的相似性是79.7%～99.2%。GD1、HN2、SY87和YY158的E基因相似性是99.9%,与其他四株蝙蝠乙脑病毒分离株的E基因相似性是99.2%～99.3%,与其他乙脑病毒E基因的相似性是78.0%～99.3%。GD1和HN2的基因组氨基酸相似性是99.9%,与其他四株蝙蝠乙脑病毒分离株(GB30、B58、HB49和HB97)的氨基酸相似性是99.4%～99.5%,与其他乙脑病毒株的氨基酸相似性是91.3%～99.4%。GD1、HN2、SY87和YY158的E蛋白相似性是99.9%,与其他四株蝙蝠乙脑病毒分离株的E蛋白相似性是98.6%～99.0%,与其他乙脑病毒E蛋白的氨基酸相似性是91.0%～99.2%。将 B58、GB30、HB49、HB97 株、Nakayama 株、SA 14-14-2 株、P3 株、WHE株、Beijing-1株和GD1、HN2株的核苷酸、氨基酸相比较均发现存在突变和缺失等情况,但大部分是沉默突变。基于E基因的进化树分析发现GD1、HN2、SY87和YY158株相互邻近,均属于GⅢ型;与分离自1982年中国蚊子的BN19株距离很近;与分离自1979年的中国病人的Liyujie株接近;与同样分离自蝙蝠的B58、GB30、HB49和HB97均邻近。基于M基因、NS1基因的进化树分析发现GD1和HN2株相互邻近,均属于GⅢ型,且与B58、GB30、HB49和HB97均邻近。研究结论1蝙蝠乙脑分离株GD1株、HN2株对BHK-21细胞和乳鼠具有致病力。2 GD1、HN2、SY87和YY158株与其他4株蝙蝠乙脑病毒分离株B58、GB30、HB49和HB97汇聚在一个进化树分支中,均属于GⅢ型。3 尽管GD1、HN2、SY87和YY158株和BN19株(中国蚊源株)、Liyujie株(中国人源株)有一些氨基酸不同,GD1、HN2、SY87和YY158株进化距离上很接近BN19株和Liyujie株。4蝙蝠有可能是乙脑病毒的储存宿主,此外,它们可能参与乙脑病毒在人畜中的传播。