随着现代生物技术的蓬勃发展,以细胞模型为基础的高通量、高内涵筛选技术在药物研发领域得到了广泛应用,也为中药药效物质的发现提供了新的研究思路与技术手段。阿霉素(Doxorubicin, DOX)是临床上常用的广谱抗肿瘤药物之一,被广泛地应用于实体瘤、白血病、淋巴瘤、乳腺癌等肿瘤治疗。但阿霉素会产生累积性、剂量依赖性的心肌毒性,并进一步发展成不可逆性心肌损伤,最终导致充血性心力衰竭,因此严重地抑制了其临床应用。阿霉素诱导心肌毒性的机制至今仍未完全阐明,现主要认为阿霉素诱发心肌毒性是多因素共同的作用结果,主要包括自由基损伤、细胞凋亡、线粒体损伤、钙离子超载、能量代谢改变等。本文采用细胞荧光显微图像技术和细胞显微图像自动获取与分析平台,建立了基于双色荧光标记的抗阿霉素心肌细胞毒性的活性物质筛选方法,进行了一系列初步探索。主要研究成果如下：1.根据阿霉素损伤心肌细胞的机制选取了三种荧光染料进行研究,其中荧光染料FDA用于标示细胞整体活力,Hoechst用于标记细胞核,Mito Tracker Red(MTR)用于标记线粒体膜电位。在离体培养H9c2心肌细胞模型上,分别考察了三种荧光染料标记细胞时荧光强度与细胞密度的线性关系,以及不同浓度阿霉素损伤后荧光强度变化规律。结果表明,FDA和Hoechst标记细胞时有较好表现(线性关系R2>0.9),而MTR不适用。2.采用FDA和Hoechst两种荧光染料标记H9c2心肌细胞,考察单色荧光染料标记和双色荧光标记下阿霉素损伤心肌细胞的量效关系,结果表明FDA和Hoechst双色荧光标记时两种荧光染料彼此间无显著干扰。在此基础上,用阳性药芦丁对该方法的可靠性进行了验证。结果表明,根据FDA和Hoechst荧光强度计算得到阿霉素的IC50分别为0.82±0.02和0.17±0.01μM,均与文献报道较为接近。阳性药芦丁在100μM浓度下保护率分别约为53.6%和38.9%,表明该方法可以用于抗阿霉素心肌细胞毒性活性物质筛选。3.采用上述建立的双色荧光标记方法,对临床上用于辅助化疗药物治疗的中药复方贞芪扶正中52个组分进行筛选,发现了5个具有较强心肌保护活性的组分。采用液相色谱一质谱联用技术(LC-MS)对活性组分进行了分析,鉴定推断出了10个可能的活性化合物。对其中的两个化合物羟基酪醇和新女贞子苷进行了活性验证实验,结果显示其心肌保护活性呈现出明显的量效关系,在80μM浓度下,FDA标记时保护率分别约为19.1%和29.6%,Hoechst标记时保护率分别约为30.0%和24.2%。综上所述,本文发展了一种基于双色荧光标记的细胞显微图像分析方法用于中药活性物质筛选,可同时考察细胞整体活力变化和细胞凋亡程度进而实现心肌保护活性物质的筛选,将其应用于中药贞芪扶正中活性物质的筛选,发现了5个活性组分和2个活性化合物,为抗阿霉素心肌活性物质发现提供了一种新方法。