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研究背景:系统性红斑狼疮（system lupus srythematosus,SLE）可累及全身多个器官,包括肾脏、皮肤、血液系统、神经系统等等。狼疮性肾炎（lupus nephritis,LN）是系统性红斑狼疮最常见的并发症。根据南京军区总医院统计,继发性肾小球肾炎中狼疮肾炎占54.3%[1]。30%-50%的系统性红斑狼疮患者在疾病早期即出现肾病综合征、急进性肾炎、尿液检查异常等肾脏损害的临床表现,其中以急进性肾炎为表现者肾功能损伤最重。南京总医院解放军肾脏病研究所统计1352例狼疮性肾炎的临床与免疫学特征,总计17.5%出现急性肾功能衰竭;国外临床数据提示表现为急进性肾炎者达到30%。狼疮性肾炎患者出现快速的肾功能丢失的常见原因有:（1）形成弥漫性的细胞性的新月体;（2）大量血栓堵塞毛细血管襻;（3）狼疮性肾血管病变,如血栓性微血管病;（4）急性间质性肾炎;（5）肾静脉血栓,偶见肾动脉血栓。如活动性病变未得到有效控制,患者可进入慢性肾功能不全甚至尿毒症,而这部分病人的肾脏病理类型常常是IV型或IV型伴V型。狼疮性肾炎有多种病理类型,其中IV型为弥漫性狼疮性肾炎,超过50%肾小球受累。根据病变活动程度,累及的病变范围,以及增生病变在毛细血管内或外等特点又可以做进一步的描述。目前认为狼疮性肾炎的发病机制涉及到遗传背景、环境因素、性激素代谢异常、Treg数量减少、B细胞异常增殖活化、自身抗体生成、补体异常活化以及免疫复合物肾脏内沉积等诸多因素,有非常复杂的调控网络。有研究者发现IgG1和IgG3在以增殖性为主的肾炎中通过经典和替代两条途径激活补体系统[2];而V型狼疮性肾炎中IgG以IgG4为主,主要通过替代途径活化补体[3]。尽管如此,狼疮性肾炎的发病机制仍未能够完全阐明。KDIGO指南要求狼疮性肾炎均需要做肾脏穿刺活检,根据肾脏病理特点确定治疗方案[4]。特别是肾脏活检发现细胞性新月体的时候,意味着快速的肾功能衰竭正在发生。此时如不给予大剂量糖皮质激素或环磷酰胺冲击诱导治疗,错过有限的最佳治疗时间窗,细胞性新月体纤维化之后,肾功能衰竭将难以恢复。但由于肾脏活检的有创性,并不能频繁的安排狼疮性肾炎患者进行定期活检评估肾脏病理情况。因此,我们需要寻找可靠的生物标志物用于无创性诊断和长期监测、评估是否出现威胁性极大的IV型狼疮性肾炎以及细胞性新月体的病理情况。miRNAs在肾脏的内稳态和疾病进程中有重要作用[5,6]。miRNA从细胞中释放到尿液中,可以结合RNA结合蛋白或打包进外泌体[7–9]。随着体液活检在近年来的快速发展,外泌体miRNA作为多种疾病诊断的生物标志物引起了越来越多的关注。外泌体是直径30-120nm的小囊泡,存在于包括血液、尿液、唾液、乳汁、脑脊液等在内的几乎所有的生物体液中[10–13]。外泌体作为一种细胞外囊泡的亚型,区别于其他囊泡的特点在于它们在细胞内的生物学来源不同:成熟的多泡体融合细胞膜去释放外泌体到细胞外空间。外泌体包含miRNA、lncRNA、mRNA和蛋白质等[14,15],将生物学信息从来源细胞传递到靶细胞。肾单位的所有细胞均能分泌外泌体[15][16]。它能准确的表现肾功能障碍和结构损伤,被认为是传播信息的重要途径[17]。因此,尿外泌体运载的miRNA可作为潜在的生物标志物的用于肾脏疾病的诊断和预后[18,19]。尿液miRNAs有来自于循环中通过肾小球滤过的miRNAs,但更多的是源于肾单位外泌体运载的富含肾脏特定信息的miRNAs[20,21]。这一发现和研究进展使得临床上对持续动态观察狼疮性肾炎患者肾脏病理的演变,评估病情进展成为可能,对狼疮性肾炎的调控网络研究和临床相关疾病的治疗产生重大的影响。近期的研究证实,尿液外泌体miRNAs表达谱在局灶节段性肾小球硬化和微小病变肾病的患者中有155个miRNAs表达有差异[22],miR-145在I型糖尿病肾病尿液外泌体中富集而II型糖尿病肾病患者与健康人尿液外泌体相比有16个miRNAs表达有差异[23,24]。miR-29c在尿液外泌体中的表达水平可预测狼疮性肾炎的早期纤维化[25]。这就提示我们:尿液外泌体miRNA表达谱的改变准确的反映了在该肾病的病理生理特点,为我们打开一扇持续监测肾脏病理改变新的窗户,为研究肾脏病理机制和早期诊断和治疗指明的新的方向。目的:在本研究中,我们从活动性的IV型狼疮性肾炎伴细胞性新月体、活动性的IV型狼疮性肾炎不伴细胞性新月体、非活动性IV性狼疮性肾炎以及健康人的晨尿外泌体中入手,探索尿液外泌体miRNA表达谱在各组之间的表达特点及调控关系,寻找IV型狼疮性肾炎及细胞性新月体的新的生物标志物。方法:1.样本来源及分组:所有狼疮性肾炎病人于2016年1月-2018年1月在大学第一附属医院肾内科就诊,均接受肾脏活检明确病理分型并确定是否伴有细胞性新月体。健康志愿者来源于该医院体检中心,在研究中作为对照组。健康人定义为没有狼疮、乙肝、糖尿病、高血压等系统性疾病,肾功能或eGFR正常,没有血尿、蛋白尿或白细胞尿。遵照2008年修订的《赫尔辛基宣言》,该研究方案经医学院第一附属医院伦理委员会批准。所有受试者已签署书面知情同意书,留取晨尿100ml并在1小时内进行处理;2.提取尿液外泌体采用超高速离心法从尿液中提取外泌体:初步离心2500g,30min以去除细胞和残渣,在4℃下17000g离心30min去除大囊泡;超高速离心机4℃下200000g离心70min,去除上清液得到初步颗粒化的外泌体;再次超高速离心机4℃下200000g离心70min得到颗粒化的外泌体,加入PBS存入-80℃冰箱待用;3.透射电子显微镜检测使用透射电镜检测外泌体形态和直径,确认外泌体外观特征。取出-80℃冰箱待用的外泌体并加入PBS重悬浮。在封口膜上滴一滴大约30ul的外泌体悬浮液,并将铜网膜面置于每一滴外泌体悬浮液上面,悬浮吸附约10分钟,用滤纸缓慢吸干。转移铜网至1%醋酸双氧铀染液（1克醋酸双氧铀溶于100ML双蒸水配制而成）液滴上,染色10分钟,用滤纸缓慢吸干。转移铜网到双蒸水液滴上,3次,每次2分钟,用滤纸吸干。待其在自然晾干后,日本电子透射电子显微镜（型号:JEM-1400/JEM-1400 PLUS,日本产）观察:使用电压:100KV,在荧光屏中低倍找到观察的区域,插入CCD（gatan公司,型号:830）观察、寻找外泌体、调试电镜至图像清晰,采集需要的图像。4.外泌体粒径分布检测使用ZETASIZER Nano series-Nano-ZS检测外泌体粒径分布。经过前面步骤提取得到的外泌体用PBS重悬浮。按照标准操作规范上机检测:ZETASIZER Nano series-Nano-ZS。获得的粒径分布图见后文附图。5.流式细胞仪表面标记物检测取出-80℃冰箱待用的外泌体并加入PBS重悬浮。取两份样品（编号DCX、HSF）一部分使用不染色外泌体作为阴性对照,标记为NC;另一部分分别进行CD63和CD81两组抗体染色,标记为CD63和CD81。按照仪器操作规程上机检测:BD accuri C6 flow cytomenter。6.Western blot检测通过Western blot检测CD9、CD81等外泌体表明标志是否存在,非外泌体表面标志Calnexin是否存在。尿液外泌体溶解在RIPA缓冲液中,然后离心12000g,15分钟,收集上清液并且转运到新的EP管里。等量的可溶性总蛋白在8%的SDS-PAGE（Life Technologies,USA）电泳并且转运到一个PVDF膜上分析每个样品。使用CD9兔抗（1:1000）和CD81兔抗（1:1000）,还有非外泌体标志物的Calnexin鼠多克隆抗体（1:1000）作为一抗孵育。之后选择辣根过氧化物酶标记的二抗。使用化学发光试剂盒（Beyotime,Shanghai,China）和X射线胶片曝光。7.高通量测序通过Illumina HiSeqTM 2500测序,得到各组的miRNA表达谱,并根据计算出表达有统计学差异的miRNAs。对于sRNA测序实验,从总RNA提取到最终的cDNA文库制备完成主要包括以下步骤:总RNA分别连接5`接头盒3`接头;第一链cDNA合成然后PCR扩增;通过凝胶电泳法得到cDNA文库;上机测序。测序所得到的初步序列集合还需要进一步处理:排除污染、低质量的序列,并且去除两端的接头之后,得到clean reads。通过数据库对比,可以对其中所包含的各种sRNA的构成和各自的表达量进行统计和注解。未能在已有数据库中找到对应注释的片段可以进行新的miRNA的预测。8.Heatmap聚类分析通过Multi Experiment Viewer（V4.9.0）软件,选择进行Gene Tree和Sapmle Tree的HCL Analysis,采用Optimize Gene Leaf Order和Optimize Sample Leaf Order,选择红蓝色调和调整数据显示格式后得到:IV型狼疮性肾炎与健康人之间的Heatmap;活动性IV型狼疮性肾炎与非活动性IV型狼疮性肾炎之间的Heatmanp;活动性IV型狼疮性肾炎与健康人之间的Heatmanp;活动性的IV型狼疮性肾炎伴细胞性新月体与活动性的IV型狼疮性肾炎不伴细胞性新月体之间的Heatmap。9.Volcano plot图谱分析通过E Chart输入上述各组的测序数据,分析并得到Volcano plot图谱,显示出尿液外泌体miRNAs的表达量分布图和|Fc|高低,展示出IV狼疮性肾炎与健康人群的尿液外泌体miRNA的表达差异;IV狼疮性肾炎活动状态与非活动状态的尿液外泌体miRNA的表达差异;活动性IV型狼疮性肾炎中有细胞性新月体与无细胞性新月体之间的尿液外泌体miRNA的表达差异;10.差异miRNAs的通路分析使用DIANA miRPath（V3.0）对以上各组间显著差异的miRNAs进行通路分析,探寻不同病理情况下差异表达的miRNAs可能涉及到的信号通路。通过对TargetScan、Tarbase7.0、microT-CDS（v5.0）等3个数据库的DIANA-mirPath结果取交集,并排除肿瘤、乙肝、白血病、甲状腺激素相关的通路之后,得到以下与IV型LN以及细胞性新月体相关的通路,p值以及作用的基因和miRNAs;11.TF预测利用JASPAR数据库中各模型的PSSM（Position-Specific Scoring Matrices）矩阵进行TF（transcription factor）预测;使用宾夕法尼亚大学计算生物学及信息学实验室研发的TESS软件根据TF结合部位在基因组中分布的不平衡性,应用权重矩阵数据库搜索TF的结合部位;用FIMO（Find Individual Motif Occurrence）软件包利用已知motif的MEME（Multiple EM for Motif Elicitation）矩阵搜索序列中潜在的motif的匹配位点。综合上述三个预测软件得到的TF的预测结果,并将三种方法都可预测到的TF作为候选TF;12.miRNA的靶基因预测通过TargetScan,miRDB,miRTarBase和miRWalk这四个预测软件对IV狼疮性肾炎与健康人群的尿液外泌体的表达差异miRNA、IV狼疮性肾炎活动状态与非活动状态的尿液外泌体的表达差异miRNA、IV型狼疮性肾炎伴与不伴细胞性新月体两组之间差异miRNAs的作用靶点进行分析,综合上诉四个预测软件得到的miRNA靶基因结果,并将多种算法预测的结果和实验证实的结果取交集,作为各组间差异miRNAs的候选靶基因;13.TF-miRNAs-mRNA网络分析综合上述候选TF、miRNAs和miRNAs的候选靶基因,按照TF和miRNA的结合关系,miRNA与基因间的靶向调控关系,用Cytoscape建立以miRNA为基础的调控网络,包括转录因子、miRNAs、mRNA和相互作用的可视化网络图。根据TF-miRNAs-mRNA网络图,可以直观的了解以miRNA为中心的调控网络的关键节点,并根据其上游和下游节点链接数量Degree评分,筛选出影响最大的重要miRNA;结合临床标本高通量测序结果的各组间差异表达分析,进一步筛选出下一步研究的候选miRNAs;14.RT-qPCR验证建立验证组并验证候选miRNA:收集活动性的IV型狼疮性肾炎伴细胞性新月体10例、活动性的IV型狼疮性肾炎不伴细胞性新月体10例、非活动性IV性狼疮性肾炎10例以及健康人10例的晨尿100mlPCR验证其表达量,并确证测序结果准确可靠。选定的3个miRNAs（miR-3135b,miR-654-5p,miR-146a-5p）进行RT-qPCR实验。将尿液外泌体样本从-80摄氏度储存环境中取出并置于冰上,加PBS重悬浮,2500g离心20分钟,转移上清液至新管,放冰上,提取RNA后用Qubit 3.0检测样本RNA浓度,并加入外参cel-miR-39-3p的mimic（10uM）1ul,涡旋混匀,-80摄氏度保存。cDNA反转录:以样品提取的总RNA为模板,建立包括RT Mix,RT primer（C）（10uM）,RNA template,ddH2O的反应体系,混匀后离心收集液体至管底,42℃*60分钟,72摄氏度*10分钟,产物即为cDNA模板。定量PCR:建立包括RNase-free H2O,Forward primer（10uM）,Reverse primer（10uM）,SYBR Green Surpermix,cDNA模板的反应体系,进行PCR扩增并制作溶解曲线:70℃至95℃之间,每0.5℃读版一次并停5s。15.ROC分析根据RT-qPCR的结果确认测序结果准确可靠,使用SPSS（V.19.0.0）进行ROC分析筛选出的miR-3135b、miR-654-5p和miR-146a-5p的表达量,计算AUC、尤登指数和p值等,分别计算这3个miRNA对IV型狼疮性肾炎伴细胞性新月体的诊断敏感性和特异性。结论:1.按照研究计划收集活动性/非活动性/伴有细胞性新月体/无细胞性新月体等各种特点的IV型狼疮性肾炎患者和健康人晨尿,并采用超高速离心法提取人尿液外泌体。采用透射电子显微镜、ZETASIZER Nano series-Nano-ZS、流式细胞仪、Western blot等多种方法评估所获得的外泌体的整体形态、粒径分布、特异性表面标志是否存在及其分布比例,证实并优化尿液外泌体获取质量。2.通过对尿液外泌体miRNA进行高通量测序,在活动性IV型狼疮伴有新月体、IV型狼疮无新月体,非活动性IV型LN及健康人组等各组比较中得到了差异表达的miRNA;3.分析这组间差异表达的miRNAs,得到了IV型狼疮性肾炎中与细胞性新月体相关的15条信号通路;4.基于多个数据库的生物信息学分析,预测了候选TF和mRNA,建立了以miRNA为基础,包括TF、miRNA和mRNA和他们之间的相互关系的共表达网络;5.选出3个miRNAs（miR-3135b,miR-654-5p,miR-146a-5p）用RT-qPCR的方法在IV型狼疮伴有新月体、IV型狼疮无新月体,非活动性IV型LN及健康人中验证,并绘制了ROC曲线,发现miR-3135b和miR-654-5p能区分IV型狼疮性肾炎伴或不伴细胞性新月体,其AUC波动在0.910-0.911（p<0.001）。6.综上:这些结果表明IV型LN中细胞性新月体的形成涉及到复杂的信号通路和调控网络,尿液外泌体miR-3135b和miR-654-5p可以作为诊断IV型狼疮性肾炎是否伴细胞性新月体的生物标志物。