水稻是世界上最重要的粮食作物之一,全球约二分之一的人口以稻米为主食,传统的遗传育种方法在提高水稻产量、抗性和品质方面已作出了重要贡献,但由于稻属种质资源的限制及常规育种方法的局限性,给水稻进一步的遗传改良带来一定困难。随着分子生物学研究的深入,基因的分离、克隆和重组技术以及转基因技术的日趋成熟,遗传转化已成为水稻遗传改良的一种有效手段。抗虫、抗病和抗除草剂转基因水稻的培育可为水稻的高产与稳产提供重要保证,也可减少化学农药的使用,改善环境质量。通过调控淀粉合成相关基因的表达,可以改良稻米的淀粉品质,以提高其食味品质或加工品质。本研究重点利用转基因技术进行水稻改良的研究,主要研究内容包括两大方面。一是将不同来源的抗虫、抗病和抗除草剂基因,包括苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)毒蛋白cryIA(c)基因、雪花莲凝集素(Galanthus nivalis agglutinin, GNA)基因、甜椒编码类铁氧还原双亲蛋白(Amphipathic protein 1, AP1)基因和土壤吸水链霉菌(bialaphos resistance, Bar)抗除草剂基因,导入4个高产粳稻品种广陵香粳、武香粳9号、武香9915和扬辐粳8号中,研究抗病、抗虫和抗除草剂转基因水稻,特别是含有不同目的基因组合的多抗转基因水稻的培育方法,二是,将控制直链淀粉合成的水稻蜡质(Waxy,Wx)基因的不同转基因构建,包括其全长基因组序列(简称全长Wx基因)、Wx-cDNA和反义RNA结构(简称反义Wx基因),导入具有不同直链淀粉含量的水稻品种协青早、龙特甫、武香粳9号、武香9915、苏御糯和广陵香糯等中,研究调控蜡质基因表达对改良稻米品质的效果,在此基础上进一步获得具有优良食味品质或特高直链淀粉含量的水稻新品种(系)。主要研究结果如下:1、转Bt基因水稻。通过双菌双载体或超双元载体介导的农杆菌介导共转化法,将Bt cryIA(c)基因和潮霉素抗性选择标记基因(HPT)同时导入粳稻品种武香粳9号和广陵香粳中,从其自交后代中筛选获得了无HPT基因的转Bt基因水稻材料。抗虫性鉴定结果表明,转Bt基因水稻对稻纵卷叶螟和二化螟的抗性较未转化对照有了明显提高,具体表现为:稻纵卷叶螟对转Bt基因水稻离体叶片的危害程度明显小于未转化对照,转Bt基因水稻离体叶片上的稻纵卷叶螟幼虫全部死亡;二化螟高龄虫对分蘖期转Bt基因水稻离体茎杆危害程度明显小于未转化对照,转Bt基因植株茎杆上只有少量的螟虫排泄物;二化螟幼虫在苗期转Bt基因水稻上死亡率达到100%,较未转化对照有明显提高;二化螟造成的成株期转Bt基因水稻的枯心率明显低于未转化对照,部分转化子对二化螟的抗性由未转化对照的高感上升为抗或中抗级别;在不施用任何农药的田间自然条件下,转Bt基因水稻表现为无稻纵卷叶螟危害,未转化对照的受害率达100%。2、转AP1基因水稻。通过超双元载体介导的农杆菌共转化法,将AP1基因和HPT基因同时导入粳稻品种武香粳9号、广陵香粳中,从其自交后代中筛选获得了含有AP1基因而无HPT基因的水稻。抗病性鉴定结果表明,转AP1基因水稻叶片上白叶枯病病斑长度均极显著小于未转化对照,广陵香粳转基因水稻的抗性级别由未转化对照的中抗上升为抗;转AP1基因水稻虽然与未转化对照对纹枯病的抗性级别均为中感,但相对病班长度均显著或极显著地小于未转化对照;大部分转AP1基因水稻对稻曲病的抗性较未转化对照有所提高。3、转GNA和Bar基因水稻。以粳稻品种广陵香粳、武香9915和扬辐粳8号为材料,以同时含有GNA和Bar基因的双元载体EHA105/pCUGNA-BAR介导的转化法,将GNA和Bar基因导入以上受体品种中,通过除草剂抗性鉴定和PCR分析,筛选获得了同时含有Bar基因和GNA基因的纯合转基因水稻。抗性鉴定表明,褐飞虱在转基因水稻上的进食量显著低于未转化对照和感虫对照品种台农本地1号(TN1),褐飞虱在转基因水稻上的繁殖率亦显著低于未转化对照,即转基因水稻对褐飞虱的进食量和繁殖率有明显的抑制作用;转基因水稻4901-1苗期对褐飞虱的抗性达到了中抗水平,较未转化对照扬辐粳8号的感虫水平有了明显提高。4、聚合多个抗性基因培育多抗转基因水稻。利用双菌双载体介导的共转化,将AP1基因、Bt基因和HPT基因同时导入粳稻品种广陵香粳中,并将其与同时含有GNA和Bar基因的转基因水稻杂交,从其自交后代中筛选获得了同时含有两个、三个或四个目的基因、但无HPT基因的多种类型的多价转基因水稻材料。通过抗性鉴定试验表明,这些多价转基因水稻表现出预期的抗病和/或抗螟虫和/或抗飞虱和除草剂的多抗特性,具体表现为:(1)含AP1基因的多价转基因水稻对白叶枯病(KS-1-20)的抗性级别与只含AP1基因的单价转基因水稻的抗性级别相同,均由未转化对照的中抗上升为抗病水平,但多价转基因水稻的病斑长度较只含AP1基因的单价转基因水稻有极显著地减小,且GNA基因和Bar基因对白叶枯病抗性的提高程度要大于Bt基因;用4个白叶枯病菌种混合后接种,同样表现为GNA基因和Bar基因可提高含AP1基因转基因水稻对白叶枯病的抗性;含AP1基因多价转基因水稻对纹枯病的抗性级别由未转化对照的中感上升为抗病,且GNA和Bar基因对纹枯病的抗性的提高程度大于Bt基因;(2)含Bt基因的多价转基因水稻对稻纵卷叶螟、二化螟抗性较未转化对照有了明显提高,具体表现为,稻纵卷叶螟对含Bt基因的多价转水稻离体叶片的危害程度明显小于未转化对照,含Bt基因的多价转水稻离体叶片上的稻纵卷叶螟幼虫全部死亡;含Bt基因的多价转水稻对二化螟的抗性由未转化对照的高感上升为抗或中抗级别;在不施用任何农药的田间自然条件下,含Bt基因的多价转基因水稻表现为无稻纵卷叶螟危害,未转化对照的受害率达100%;(3)褐飞虱取食含GNA基因的多价转基因水稻后排泄的蜜露量均较未转化对照和感虫对照品种TN1有极显著的减少,含GNA基因的不同多价转基因水稻上褐飞虱排泄的蜜露量差异不显著。5、转反义Wx基因水稻及其品质分析。从通过双菌双载体或超双元载体介导的共转化获得的武香粳9号、协青早和龙特甫转反义Wx基因水稻的自交后代中,筛选获得了无HPT基因的转反义Wx基因水稻。对转反义Wx基因水稻的分析表明:(1)反义Wx基因导入水稻后,可抑制转基因水稻胚乳中内源Wx基因的表达,表现为未成熟种子胚乳中的成熟2.3-kbWx基因RNA以及未剪切的3.3-kbWx基因RNA量均较未转化对照降低,成熟种子胚乳中的Wx蛋白表达量,直链淀粉含量较未转化对照有不同程度的降低,且在粳稻和籼稻中都选育获得了直链淀粉含量降低到糯性水平的转基因水稻植株;(2)直链淀粉含量降低后,对种子的其它淀粉品质性状也有明显的影响,表现为胶稠度变软;糊化温度在不同品种中表现不同,武香粳9号和协青早的转基因水稻,直链淀粉含量下降后,糊化温度变化不显著,龙特甫的转基因水稻,当直链淀粉含量明显下降后,糊化温度极显著升高;转基因水稻中的直链淀粉含量降低后对淀粉粘滞性谱(RVA)特性也有一些影响,但不同来源的转反义Wx基因水稻的表现不完全一致。当直链淀粉含量降低到糯性水平时,转基因水稻RVA谱的PKV、HPV和CPV均极显著降低;(3)当转基因水稻籽粒中直链淀粉含量极显著降低时,淀粉粒的充实情况变差;(4)转基因水稻直链淀粉含量降至糯性水平时,千粒重明显降低,最多可降低17.05%。6、转全长Wx基因水稻及其品质分析。对EHA105/p13W2介导获得的协青早、龙特甫、武香粳9号、武香9915和广陵香糯的转全长Wx基因水稻的分析表明:(1)全长Wx基因导入水稻后,大部分转基因水稻中Wx基因的表达量提高,表现为未成熟种子胚乳中的2.3-kbWx基因RNA量较未转化对照升高,成熟种子胚乳中的Wx蛋白表达量,直链淀粉含量较未转化对照有不同程度的升高,糯稻、粳稻和籼稻的转基因水稻的直链淀粉含量分别可达24.92%、24.14%,和27.52%,分别较对照提高了22.91%、9.72%和2.99%,即与籼稻相比,糯稻和粳稻品种转基因水稻中升高的幅度较大;(2)直链淀粉含量提高后,糯稻和粳稻转全长Wx基因水稻的胶稠度变硬,而籼稻转全长Wx基因水稻因其直链淀粉含量变化较小,胶稠度也无显著变化;广陵香糯来源的转基因水稻的糊化温度极显著降低,而其余四个品种转基因水稻的糊化温度均未发生显著变化;不同品种的转全长Wx基因水稻的RVA谱与未转化对照相比,表现出不同的差异;(4)粳稻和糯稻的转全长Wx基因水稻的直链淀粉含量升高幅度较大时,淀粉粒的充实情况变好,籼稻的转全长Wx基因水稻,因其直链淀粉含量升高幅度较小,其淀粉粒的变化亦较小;(5)糯稻和粳稻的转全长Wx基因水稻,当直链淀粉含量提高明显时,糙米千粒重有所提高,最高可较对照增加16.89%。7、糯稻中表达Wx cDNA及其对稻米品质的影响。以双菌双载体介导的共转化法,将Wx cDNA和HPT基因同时导入到了广陵香糯和苏御糯中。对转Wx-cDNA水稻成熟种子的分析结果表明:(1)大部分转Wx cDNA水稻胚乳中的Wx蛋白表达量提高,直链淀粉含量有不同程度的提高;(2)直链淀粉含量提高后,转Wx cDNA水稻的胶稠度变硬,糊化温度的变化在不同转化子中表现不完全一致,有升高也有降低;(3)当转Wx cDNA水稻的直链含量提高时,其RVA谱的特征值PKV、HPV和CPV均较相应的未转化对照大;(5)当直链淀粉含量明显升高时,转Wx cDNA水稻的淀粉粒的充实情况变好,糙米千粒重有所提高,最高可较对照增加8.56 %。