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目的:
建立快速、灵敏的血清腺苷脱氨酶匀相法(Adenosine Deaminase,ADA)检测新技术。
方法:
通过酶催化反应动力学体系选择、表面活性剂选择、液体酶稳定条件、近中性体系下荧光、化学发光法实验条件的选择等关键技术研究,建立了嘌呤核苷磷酸化酶-黄嘌呤氧化酶-过氧化物酶(PNP-XTO-POD)偶联可见光匀相终点法测定血清ADA、PNP-XTO-POD偶联单一试剂可见光匀相速率法测定血清ADA、嘌呤核苷磷酸化酶-黄嘌呤氧化酶-尿酸酶-过氧化物酶(PNP-XTO-UAO-POD)偶联双试剂可见光匀相速率法测定血清ADA、PNP-XTO-POD偶联荧光匀相终点法测定血清ADA、PNP-XTO-POD偶联化学发光匀相终点法测定血清ADA的新方法。
结果:
PNP-XTO-POD偶联可见光匀相终点法测定血清ADA,线性范围为0.10～140.00U/L,平均回收率为100.30％,批内变异系数(CV)和批间变异系数分别为0.018～0.032和0.031～0.037,与美国Diazyme Laboratores提供的ADA连续监测法比较具有良好的相关性,线性回归方程和相关系数分别为Y=1.0023X-0.0953,r=0.9998,与全国临床检验操作规程第三版速率法比较具有良好的相关性,线性回归方程和相关系数分别为Y=0.9982X+0.2915,r=0.9996,胆红素少于20.00mg/dL、甘油三酯少于750.00mg/dL、血红蛋白少于100.00mg/dL、抗坏血酸少于4.00mg/dL对37.00U/L腺苷脱氨酶测定无干扰,250例健康人群的血清ADA活性为3.90～20.30U/L。
PNP-XTO-POD偶联单一试剂可见光匀相速率法测定血清ADA,线性范围为0.08～129.00U/L,平均回收率为99.40％,批内变异系数(CV)和批间变异系数分别为0.013～0.031和022～0.041,与美国Diazyme Laboratores提供的ADA检测试剂方法比较具有良好的相关性,线性回归方程和相关系数分别为Y=0.9999X+0.0545,r=0.9973,与全国临床检验操作规程第三版速率法比较具有良好的相关性,线性回归方程和相关系数分别为Y:1.0001X-0.0300,r=0.9990,胆红素少于22.00mg/dL、甘油三酯少于780.00mg/dL、血红蛋白少于100.00mg/dL、抗坏血酸少于4.00mg/dL对37.00U/L腺苷脱氨酶测定无干扰,250例健康人群的血清ADA活性为3.90～20.30U/L。
PNP-XTO-UAO-POD偶联双试剂可见光匀相速率法测定血清ADA,线性范围可达0.05～129.00U/L,平均回收率为101.70％,批内变异系数(CV)和批间变异系数分别为0.011～0.029和0.025～0.034,与美国Diazyme Laboratores提供的ADA连续监测法比较具有良好的相关性,线性回归方程和相关系数分别为Y=0.9951X+0.6074,r=0.9990,与全国临床检验操作规程第三版速率法比较具有良好的相关性,线性回归方程和相关系数分别为Y=0.9990X+0.2716,r=0.9993,胆红素少于22.00mg/dL、甘油三酯少于780.00mg/dL、血红蛋白少于100.00mg/dL、抗坏血酸少于4.00mg/dL对37.00U/L腺苷脱氨酶测定无干扰,250例健康人群的血清ADA活性为3.90～20.30U/L。
PNP-XTO-POD偶联荧光匀相终点法测定血清ADA,线性范围为0.01～100.40U/L,平均回收率为99.04％,批内变异系数(CV)和批间变异系数分别为0.016～0.037和0.021～0.043,与美国Diazyme Laboratores提供的ADA连续监测法比较具有良好的相关性,线性回归方程和相关系数分别为Y=1.0029X+0.0054,r=0.9980,与全国临床检验操作规程第三版速率法比较具有良好的相关性,线性回归方程和相关系数分别为Y=1.0033X+0.0087,r=0.9987,胆红素少于25.00mg/dL、甘油三酯少于750.00mg/dL、血红蛋白少于120.00mg/dL、抗坏血酸少于4.00mg/dL对37.00U/L腺苷脱氨酶测定无干扰,250例健康人群的血清ADA活性为3.90～20.30U/L。
PNP-XTO-POD偶联化学发光匀相终点法测定血清ADA,线性范围为0.001～129.00U/L,平均回收率为100.07％,批内变异系数(CV)和批间变异系数分别为0.049～0.058和0.055～0.072,与美国Diazyme Laboratores提供的ADA连续监测法比较具有良好的相关性,线性回归方程和相关系数分别为Y=0.9708X+1.1671,r=0.9990,与全国临床检验操作规程第三版速率法比较具有良好的相关性,线性回归方程和相关系数分别为Y=0.9975X-0.5811,r=0.9990,胆红素少于25.00mg/dL、甘油三酯少于750.00mg/dL、血红蛋白少于120.00mg/dL、抗坏血酸少于4.00mg/dL对37.00U/L腺苷脱氨酶测定无干扰,250例健康人群的血清ADA活性为3.90～20.30U/L。
结论:
本研究所建立的血清ADA匀相法检测新技术,各项方法学指标满足临床实际应用需要,具有选择性好、灵敏度高、测定简便等特点,可满足不同层次的临床实验室检测血清ADA的需要,适合临床推广应用。