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【研究背景】特发性脊柱侧凸(Idiopathic scoliosis,IS)是最常见的脊柱畸形,发病率约1%～3%,其中,青少年特发性脊柱侧凸(Adolescent idiopathic scoliosis,AIS)约占80%。虽然AIS的病因还不明确,但随着分子生物学和遗传学水平的发展,AIS的遗传病因学研究逐渐深入。目前,人们普遍认为它是一种多因素作用的遗传性疾病,且有学者采用全基因扫描法将AIS相关基因定位于有限的几个染色体位点。对于研究复杂多基因相关疾病,候选基因法、关联分析、单倍体型分析法具有先进和准确的特点,如今它们已成为群体遗传学研究和疾病相关基因检测的重要手段,能够直接、简便、准确地阐述疾病相关基因的关联性和作用机制。另外,AIS作为一种临床表型复杂的疾病,目前尚无从不同的临床表型角度如PUMC分型,分组分层对AIS不同临床表型的遗传病因学机制进行研究的相关报道。【研究目的】1.通过对钙调蛋白1基因(Calmodulin 1,CALM1基因)与AIS之间的关联分析,明确其在AIS发病机制中发挥的效应。2.通过对CALM1基因SNPs位点等位基因/基因型与AIS临床表型的关联分析,在基因水平上探索CALM1基因与AIS不同临床表型之间的关系,从遗传学上丰富AIS临床表型的内容。3.根据研究结果提出可能的AIS病因学假说。【研究方法】本实验采用以医院为基础的“病例-对照”研究。1.研究对象:根据入选和排除标准选取2005年10月至2008年2月期间北京协和医院骨科收治并已确诊的汉族青少年特发性脊柱侧凸患者,共146例,其中男性24例,女性122例,平均年龄14.89岁(10～20岁)。对照组则为同期北京协和医院收治的感染或创伤患者、健康查体者等汉族患者,共146例,男性24例,女性122例,平均年龄15.18岁(10～20岁)。2.研究方法(1)QIAamp(?) DNA Blood Mini Kit试剂盒提取DNA;(2)根据国际人类基因组单倍体型图计划(http://www.hapmap.org/)提供的基因型数据,应用Haploview 4.0软件选取CALM1基因的SNPs位点,优先选取杂合度高于10%,位于外显子区域或有错义突变的SNPs和位于3’-、5’-调控区的SNPs作为遗传标记、共选取14个SNPs;(3)分别按照侧凸顶点所在位置(主弯)、PUMC分型对病例组进行分组;(4)在所有146例AIS患者和146例对照组中应用超高通量的SNP分型系统——SNPstream UHT Genotyping System对所选SNPs进行基因型鉴定;(5)拟合优度x2检验(Goodness-of-fit Chi-square test)分析病例、对照组基因型频率的分布是否符合H-W平衡;(6)基于基因型/等位基因频率的“病例-对照”关联分析及病例组不同临床表型之间的关联分析;(7)在基因型/等位基因频率关联分析基础上,应用在线软件(SNPstats)进行非条件Logistic回归模型评估单位点基因型与AIS发生风险的相关程度,并计算优势比(OR)及95%可信区间(CIs);(8)连锁不平衡和单倍体型分析:应用Haploview 4.0软件计算CALM1基因所有单倍体型在病例组和对照组之间的分布差异。【研究结果】1.流行病学资料分析:病例组和对照组之间年龄、性别分布无统计学差异。2.因rs12885713、rs5871引物设计失败,故研究中放弃这两个位点,最终对CALM1基因的12个SNPs位点进行统计分析,这12个SNPs位点均具有多态性,其等位基因和基因型在病例组和对照组中均符合Hardy-Weinberg平衡。3.SNPs等位基因多态性—AIS:rs2300496、rs2300500和rs3213718等位基因在病例组和对照组中的分布频率统计学上存在显著差异(P值分别为0.0079,0.0079,0.0257),进一步分析得知rs2300496位点等位基因C、rs2300500位点等位基因G和rs3213718位点等位基因C与AIS的易感性升高有关。4.基因型多态性—AIS(1)rs2300496、rs2300500和rs3213718基因型在病例组和对照组中的分布频率统计学上存在显著差异(P值分别为0.0196,0.0196,0.0378),进一步分析得知rs2300496基因型C/C、rs2300500基因型G/G和rs3213718基因型C/C与AIS的易感性升高有关。在非条件Logistic回归分析中,经年龄和性别校正后,rs2300496和rs2300500基因型分布符合Codominant遗传模型(OR=0.12,95%CI=0.01-0.99,p=0.015,AIC=402.4)、Dominant遗传模型(OR=0.56,95%CI=0.34-0.92,p=0.022,AIC=403.6)和Log-additive遗传模型(OR=0.54,95%CI=0.35-0.86,p=0.0073,AIC=401.6),后者最佳(AIC值较小);rs3213718基因型分布符合Log-additive遗传模型(OR=0.60,95%CI=0.39-0.93,p=0.022,AIC=403.5)。(2)单倍体-AIS:在多位点单倍体型分析中,发现1种阳性单倍体型:SNP8C-SNP1A-SNP13C-SNP14C-SNP2C-SNP3T-SNP4G-SNP5T-SNP11C。(3)结合PUMC分型,rs2300496和rs2300500基因型在PUMCⅡ型和对照组中的分布频率统计学上存在显著差异(P值分别为0.0470,0.0470),进一步分析得知rs2300496基因型C/C、rs2300500基因型G/G与PUMCⅡ型的发生有关。(4)结合AIS主弯顶点分析,rs2300496、rs2300500和rs3213718基因型在胸弯和对照组中的分布频率统计学上存在显著差异(P值分别为0.0180,0.0180,0.0402),进一步分析得知rs2300496基因型C/C、rs2300500基因型G/G和rs3213718基因型C/C与胸弯的发生有关。(5)12个SNPs位点基因型与病例组主侧弯Cobb’s角度数之间无统计学差异。【结论】1.CALM1基因遗传变异可能与青少年特发性脊柱侧凸(AIS)发生相关,有可能是影响AIS易感性的重要因素。2.PUMCⅡ型AIS的发生可能与rs2300496和rs2300500基因型多态性有关;胸弯AIS的发生可能和rs2300496、rs2300500和rs3213718基因型多态性有关。3.AIS不同的临床表型可能和不同的SNP位点多态性有关,初步显示AIS的PUMC分型可能和不同的SNP位点多态性有关,提示PUMC分型不仅是指导临床治疗的可靠标准,而且可能是符合遗传病因学机制的合理分型。