儿茶酚氧位甲基转移酶(Catechol-O-methyltransferase, COMT; EC2.1.1.6)在体内代谢多种儿茶酚类神经递质和激素(如多巴胺、肾上腺素、去甲肾上腺素、2-羟基雌二醇、4-羟基雌二醇等)。自1958年首次报道COMT参与代谢多巴胺以来,COMT在神经学科和精神学科中受到广泛关注,研究结果显示COMT在精神功能方面具有重要的调节作用。COMT(?)(?)制剂可以有效增加左旋多巴的体内暴露量从而辅助治疗帕金森病,因此,寻找新型COMT抑制剂一直是帕金森病研究中一个热点。在药物代谢领域,COMT属于一个二相药物代谢酶,将一个甲基基团从甲基供体(S-腺苷甲硫氨酸,英文：S-adenosyl-L-methionine,缩写：SAM)转移到底物的邻二酚羟基上,该甲基化代谢对底物的药物代谢动力学和药效学将产生较大的影响。黄酮化合物是自然界中分布最为广泛的植物多酚,研究显示其具有多种药理活性,如抗肿瘤、抗氧化、抗炎等,流行病学研究提示,饮食中黄酮的摄入量与癌风险的降低存在一定的相关性。目前,一些黄酮化合物或含有黄酮的植物提取物被广泛应用到临床药物和功能食品开发中。由于黄酮的酚羟基结构,一般认为其在体内主要发生二相代谢,包括葡醛酸转移酶(UDP-glucuronosyltransferases, UGTs)和硫酸酯转移酶(Sulfotransferases,SULTs)介导的结合反应。一些黄酮分子结构中存在邻二酚羟基结构,其可以被COMT识别发生甲基化代谢,而甲基化后的黄酮仍具有药理活性,因此,研究COMT介导的邻二酚羟基黄酮的甲基化代谢,有助于阐明该类黄酮的体内过程及作用机制。本文主要研究COMT介导的菊花主要的有效成分之一——木犀草素(3’,4’,5,7-tetrahydroxyflavone, luteolin)的体内外甲基化代谢,以及甲基化代谢在木犀草素处置中的作用。第一章大鼠口服菊花提取物后木犀草素和芹菜素药动学差异研究背景和目的：前期研究大鼠口服菊花提取物(Chrysanthemum morifolium extract,CME)后的药动学发现,虽然木犀草素和芹菜素(4’,5,7-trihydroxyflavone, apigenin)分子结构相似(后者B环中少一个羟基),且两者在CME中含量接近,但是当大鼠口服CME后,血浆中木犀草素浓度显著低于芹菜素,木犀草素AUC0-t约为芹菜素的10%。根据文献报道及课题组原有研究结果(微粒体代谢、肠道水解、大鼠组织分布和排泄等)均不能解释两者巨大的血浆暴露量差异。本章主要从吸收和代谢两方面研究探讨木犀草素暴露量显著低于芹菜素的可能机制。方法：大鼠空肠单向灌流模型和绝对生物利用度模型评价大鼠肠道对木犀草素和芹菜素的吸收差异；大鼠肝微粒体一相代谢体系、大鼠肝、肾、肺、小肠组织S9孵育体系、大鼠原代肝细胞模型评价木犀草素和芹菜素的代谢稳定性差异。结果：大鼠空肠单向灌流结果显示,木犀草素的肠道通透性参数(ka,7.96min-1和Peff,4.87cm/min)仅为芹菜素(ka,18.5min-1和Peff,10.8cm/min)的50%左右；大鼠口服CME后,木犀草素的绝对生物利用度(30.4%)显著低于芹菜素(51.1%)。大鼠肝微粒体一相代谢体系中,芹菜素代谢消除显著快于木犀草素,而大鼠组织S9和原代肝细胞代谢模型上,木犀草素代谢消除显著快于芹菜素,且在水解后的木犀草素孵育样品中检测到一个未知甲基化代谢产物M。结论：肠道吸收和各组织代谢是大鼠口服CME后,造成木犀草素血浆暴露量显著低于芹菜素的两个重要原因,木犀草素的未知甲基化代谢M可能与木犀草素在大鼠体内快速消除密切相关。第二章大鼠COMT介导的木犀草素甲基化代谢研究背景和目的：推测木犀草素的未知甲基化代谢M可能与木犀草素在大鼠体内快速消除有关,因此有必要深入研究该代谢物结构及其代谢途径。因此,本章首先鉴定甲基化代谢物结构及介导其甲基化代谢的酶,并评价该代谢酶在木犀草素体内处置中的作用。方法：1)代谢物鉴定：大鼠静脉给予6.5mg/kg木犀草素前后,分别收集尿液,样品经水解处理后,HPLC分析,寻找代谢产峰,并与代谢物对照品比对紫外光谱(200-400nm)、色谱、质谱信息及查阅相关文献,确定代谢物结构。2)根据木犀草素含邻二酚羟基的结构特征,推测该甲基化代谢由COMT介导,因此,考察在有或无COMT特异性抑制剂恩他卡朋时甲基化产物量的变化,以阐明COMT的作用。3)考察大鼠不同组织(肝、肾、小肠、肺和红细胞)中两个甲基化代谢物生成酶动力学,探讨大鼠COMT对木犀草素甲基化代谢的区域选择性。4)考察给与不给恩他卡朋时大鼠静脉注射木犀草素后,木犀草素及甲基化代谢物血浆药动学和尿液排泄的变化,以阐明COMT在木犀草素体内处置中的作用。结果：1)大鼠静脉注射木犀草素后,在其尿液中发现间位(meta)甲基化木犀草素(金圣草素)和对位(para)甲基化木犀草素(香叶木素)；2)COMT(?)(?)制剂恩他卡朋显著抑制木犀草素在大鼠组织中的甲基化代谢；3)酶动力学研究结果显示,甲基化产物金圣草素和香叶木素的生成动力学均符合Michaelis-Menten方程,两者的Km接近(3.57～3.82μM),但是金圣草素的Vmax仅为香叶木素二分之一；4)恩他卡朋可以显著提高大鼠血浆和尿液中木犀草素草素的浓度,降低血浆和尿液中甲基化代谢物的生成。结论：木犀草素经大鼠COMT代谢生成meta甲基化木犀草素(金圣草素)和para甲基化木犀草素(香叶木素)；木犀草素B环上para-OH是COMT甲基化代谢的优势部位；COMT介导的甲基化代谢是木犀草素大鼠体内重要的代谢途径。第三章COMT在大鼠口服菊花提取物药动学中的作用背景和目的：研究证明COMT介导的甲基化代谢对木犀草素体内处置具有重要作用,我们推测COMT是大鼠口服菊花提取物(CME)后造成木犀草素暴露量低于芹菜素的重要原因。另外,两个甲基化代谢物(金圣草素和香叶木素)仍具有生理活性,因此,有必要在CME药动学研究中同时检测木犀草素的两个甲基化产物。本章首先建立大鼠血浆中同时测定木犀草、芹菜素、金圣草素和香叶木素的HPLC分析方法,然后应用该方法考察大鼠口服CME后木犀草素及其甲基化代谢物(金圣草素和香叶木素)的药动学及COMT(?)(?)制剂恩他卡朋对其的影响。方法：色谱分柱：Agilent Zorbax SB-C18column (250mm×3.6mm,5μm);流动相：0.1%甲酸/乙腈/甲醇=(60/16/24,v/v/v)；内标：槲皮素。按照临床前药动学研究规范要求,进行方法学验证,包括方法的专属性、线性、范围、定量下限、精密度、准确度和样品稳定性。该方法应用于大鼠口服100mg/kg CME及(100mg/kg CME+20mg/kg恩他卡朋)后四个黄酮的血浆药动学研究。结果：在本色谱条件下,四个待测成分均能基线分离,血浆中内源性物质不干扰测定；在0.025-10μg/mL范围内线性良好；定量下限均为0.025μg/mL;四个待测物提取回收率76.94-96.7%,方法回收率104.4-93.2%,批内和批间精密度均<7.0%,-80℃条件下7天内稳定(>90%)。大鼠口服CME后,血浆中检测到芹菜素、木犀草素、金圣草素和香叶木素,在同时给予恩他卡朋后,金圣草素和香叶木素血浆浓度显著降低,而木犀草素浓度显著增加。结论：COMT在大鼠口服CME后的木犀草素体内处置中发挥一定的作用。第四章人COMT大肠杆菌表达系统构建背景与目的：为深入研究人源COMT对含邻二酚羟基黄酮(如木犀草素)的甲基化代谢。本章主要构建人COMT大肠杆菌表达系统(包括野生型和108V/M突变型),为后续研究提供代谢模型。方法：1)构建pET-28a(+)-hCOMT*1(108V)和pET-28a(+)-hCOMT108*2(108M)表达质粒,利用pET-28a(+)上的组氨酸标签,形成COMT-his tag融合蛋白；2)利用E.coli Rosseta(DE3)菌株表达COMT蛋白；3)SDS-page、western blot验证目的蛋白表达；4)利用亲和纯化技术获得目的蛋白；5)用经典COMT底物槲皮素鉴定蛋白活性及比较hCOMT*1和hCOMT*2热稳定性差异。结果：成功构建了pET-28a(+)-hCOMT*1(108V)和pET-28a(+)-hCOMT108*2(108M)表达质粒,并在E.coli Rosseta(DE3)菌株中表达COMT蛋白。经过亲和纯化后,获得较高纯度(65%以上)的hCOMT*1和hCOMT*2蛋白,验证其均具有甲基化代谢活性,且hCOMT*2显示出显著的热不稳定性。结论：本研究成功构建了人COMT大肠杆菌表达系统,制备的hCOMT*1和hCOMT*2蛋白均可以作为后期人COMT代谢研究的酶源。第五章木犀草素人体内外甲基化代谢研究背景与目的：COMT识别底物的邻二酚羟基结构,只能将底物中的一个酚羟基甲基化,因此存在meta和para羟基间区域选择性。文献报道COMT底物均倾向发生meta位甲基化,而本课题研究发现,木犀草素在大鼠组织匀浆甲基化代谢中均优先发生para甲基化。为阐明人COMT介导的木犀草素甲基化是否具有同样的区域选择性,考察人COMT对木犀草素甲基化代谢的区域选择性。文献报道,体内甲基化产物的相对量与体外代谢的区域选择性存在不一致的现象,但机制尚不清楚,本研究以木犀草素为研究对象,在人体模型中进行机制研究。方法：1)利用重组人COMT模型,考察木犀草素甲基化代谢酶动力学,计算酶学参数,分析meta与para羟基间甲基化的区域选择性；2)健康志愿者3人,口服12颗脉舒胶囊(相当1mg/kg木犀草素)前后,收集尿液,样品水解后,HPLC测定其中金圣草素和(meta甲基化)和香叶木素(para甲基化)浓度并计算meta/para甲基化产物相对量；3)人肝微粒体模型和重组人CYP1A2和CYP3A4/5模型研究进一步代谢金圣草素和香叶木素的酶及其代谢特征。结果：1)酶动力学参数分别为：金圣草素和香叶木素的Vmax(pmol mg protein-1min-1)分别为：2735±313和4972±558.2,Km(μM)分布为：1.889±0.5994和2.178±0.5898,以CLint(Vmax/Km)计算金圣草素/香叶木素比值为0.62；2)人口服含木犀草素制剂后,尿液中能检测到金圣草素和香叶木素,且金圣草素/香叶木素的浓度比值为1.98±0.5,即存在人体内外木犀草素甲基化代谢产物相对量不一致的现象；3)人肝微粒体及重组酶模型显示,CYP1A2和CYP3A4/5参与催化金圣草素和香叶木素进一步的脱甲基化代谢,且香叶木素较金圣草素更容易发生脱甲基代谢生成木犀草素。结论：1)木犀草素在人COMT酶动力学研究显示,木犀草素优先发生para甲基化(meta/para:0.62),与大鼠组织匀浆中木犀草素的甲基化区域选择性一致；2)人体内外存在木犀草素甲基化代谢产物相对量不一致的现象,而CYP1A2和CYP3A4/5对para甲基化产物的优先代谢可能是造成该不一致的原因之一。