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目的：叶黄素(Lutein)是广泛存在于蔬菜、花卉和水果中的一种类胡萝卜素,近年来,越来越多的流行病学证据表明,叶黄素对多种癌症如乳腺癌、前列腺癌、直肠癌、结肠癌、皮肤癌等具有抑制作用。本文旨在研究叶黄素对人肝癌细胞株HepG2生长增殖及能量代谢的影响并探讨其可能机制。方法：1.建立反相高效液相色谱(high performance liquid chromatography, HPLC)法测定离体培养细胞内三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)及二磷酸腺昔(adenosine diphosphate, ADP)的含量。采用ODS-SPC18色谱柱(4.6mm×250mm,粒径5μm),以50mmol/L的磷酸盐缓冲液-甲醇体积比=95：5为流动相；柱温：30℃；流速：0.6ml/min;进样量：20μl；检测波长：254nm；采用标准曲线法,以色谱峰面积计算ATP. ADP含量。2.观察不同浓度的叶黄素对HepG2人肝癌细胞的抑制作用。以HepG2人肝癌细胞株和L02正常人肝细胞株为研究对象,设叶黄素低剂量组(20μmol/L)、中剂量组(40μmol/L)、高剂量组(80μmol/L)和溶剂对照组。常规细胞培养后进行叶黄素干预处理,分别进行台盼蓝染色细胞计数、噻唑蓝(3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide, MTT)染色测定细胞存活率、二氯荧光素二乙酯(2,7-dicorodihydrofluorescin diacetate, DCFH-DA)法测定活性氧自由基(reactive oxygen species, ROS)活性、HPLC法测定ATP含量、RT-PCR测定Bax mRNA及p53mRNA的表达水平。3.观察缺氧条件及叶黄素干预对HepG2人肝癌细胞能量代谢的影响。以HepG2人肝癌细胞株和L02正常人肝细胞株为研究对象,分别对其进行缺氧处理(缺氧条件为0.2%O2,缺氧时间为6h,12h和24h)并设立常氧对照。同时,对缺氧条件下的HepG2人肝癌细胞加以叶黄素干预(80μmOl/L),设立缺氧干预6h组、缺氧干预12h组、缺氧干预24h组。各组干预结束后,分别测定细胞存活率、琥珀酸脱氢酶(succinate dehydrogenase,SDH)活性和己糖激酶(hexokinase,HK)活性。结果：1.在上述色谱条件下,ATP及ADP的保留时间分别为6.9min和7.7min,两者峰形及分离良好,细胞样品中的其他成分对色谱峰无干扰。ATP及ADP的回归方程为Y=2.21×10-5X+1.40和Y=2.68×10-5X+2.12,相关系数分别为0.9996、0.9955。2.不同浓度的叶黄素对HepG2人肝癌细胞的抑制作用2.1叶黄素对人肝癌细胞株HepG2增殖的影响HepG2人肝癌细胞经叶黄素干预处理后,低、中、高剂量组的细胞存活率均较对照组显著降低(P<0.05),且细胞存活率随干预时间的增加而持续降低。而L02人正常肝细胞经相同浓度的叶黄素干预处理后,细胞存活率无显著性变化。台盼蓝细胞计数的结果与MMT法一致。2.2叶黄素对HepG2人肝癌细胞ROS水平的影响HepG2人肝癌细胞经叶黄素干预处理48h后,细胞内ROS水平较对照组显著下降(P<0.05),提示叶黄素对HepG2人肝癌细胞的氧化应激具有抑制作用。2.3叶黄素对HepG2人肝癌细胞ATP含量的影响HepG2人肝癌细胞经叶黄素干预处理48h后,细胞内ATP含量较对照组显著减少(P<0.05),并且与叶黄素浓度呈现一定的剂量效应趋势。而L02人正常肝细胞经相同浓度、相同时间的叶黄素干预后,ATP含量无显著性改变。结果提示叶黄素能够抑制肿瘤细胞能量的生成。2.4叶黄素对HepG2人肝癌细胞Bax和p53基因表达水平的影响HepG2人肝癌细胞经叶黄素干预处理48h后,高剂量组细胞Bax mRNA的表达水平及中、高剂量组p53mRNA的表达水平均显著高于对照组(P<0.05)。结果提示叶黄素能够通过上调凋亡基因的表达起到抑制癌细胞增殖的作用。3.缺氧条件及叶黄素干预对HepG2人肝癌细胞能量代谢的影响3.1缺氧条件及叶黄素干预对HepG2人肝癌细胞及L02人正常肝细胞增殖的影响与常氧组L02细胞相比,各缺氧组L02细胞的生长均受到明显抑制(P<0.05),且抑制程度与缺氧的持续时间成正比。在缺氧12h后,L02细胞出现了明显的凋亡现象。与常氧组HepG2细胞相比,缺氧组HepG2细胞在6h、12h、24h时间点上的存活率均无明显降低。在80mmol/L的叶黄素干预下,HepG2细胞对缺氧条件的耐受性减弱,在各时间点上的存活率较缺氧组显著下降(P<0.05)。3.2缺氧条件及叶黄素干预对HepG2人肝癌细胞及L02人正常肝细胞SDH和HK活性的影响与常氧组L02细胞相比,缺氧组L02细胞内SDH活性明显下降(P<0.05)并且与缺氧持续时间呈一定的剂量效应趋势,而HK活性无显著性变化。与常氧组HepG2细胞相比,缺氧组HepG2细胞内SDH活性无显著性变化,而HK活性有升高趋势,其中缺氧24h组的HK活性较对照组显著升高(P<0.05)。叶黄素干预对缺氧条件下的HepG2人肝癌细胞内SDH及HK活性均无明显影响(P>0.05)。结论：1.在本次研究的色谱条件下,ATP及ADP的峰形及分离良好,保留时间适当,ATP及ADP标准曲线在7.5-100μg/ml的范围内线性关系良好,细胞样品中无其他成分干扰,能用于准确测定离体培养细胞内ADP含量。2.叶黄素能抑制人肝癌细胞的增殖,同时对正常肝细胞无抑制作用,其机制可能与叶黄素清除细胞内ROS、抑制肝癌细胞ATP生成及上调凋亡基因Bax和p53mRNA的表达有关。3.缺氧条件下L02人正常肝细胞的生长受到抑制,SDH活性明显减低,HK活性没有显著性变化。而缺氧条件下的HepG2细胞内SDH活性并无下降,HK活性还有所升高,提示肿瘤细胞对缺氧具有一定的耐受能力,在三羧酸循环受到抑制、ATP生成不足的情况下,依赖糖酵解途径为主要的能量来源,从而使HepG2细胞的增殖在缺氧条件下未受到明显抑制。未发现叶黄素抑制HepG2细胞增殖的效应与改变SDH和HK活性有关。