论文部分内容阅读
目的：⑴颗粒酶B（Granzyme B，GrB）重组蛋白及其鼠多克隆抗体血清的制备。⑵Affibody-GrB重组质粒的构建、及其融合蛋白的制备。⑶Affibody-GrB融合蛋白细胞水平靶向宫颈癌作用的研究。⑷Affibody-GrB融合蛋白动物体内靶向宫颈癌作用的研究。 方法：①全基因人工合成经密码子优化的GrB基因序列，通过分子克隆的方法方法克隆到pET32a载体质粒中，构建pET32a-GrB重组质粒。②重组质粒pET32a-GrB转化到E.coli.BL21菌种中表达，镍柱亲和层析法获得纯化的重组GrB蛋白。③将GrB重组蛋白免疫BALB/c小鼠，ELISA法检测血清中抗体产生的水平。④免疫斑点法检验重组GrB蛋白免疫血清的特异性。⑤以实验室前期筛选出的，能够靶向结合HPV16E7的亲合配体蛋白Affibody（ZHPV16E7:127）重组质粒pET21a(+)/ZHPV16E7:127为载体；将GrB基因片段克隆到pET21a(+)/ZHPV16E7:127的EcoR I和Xho I酶切位点之间，构建重组质粒pET21a(+)/ZHPV16E7:127-GrB；同法,以野生型Affibody（Zwt）重组质粒pET21a(+)/Zwt为对照载体，构建质粒pET21a(+)/Zwt-GrB。⑥将重组质粒pET21a(+)/ZHPV16E7:127-GrB与pET21a(+)/Zwt-GrB转化到E.coli.BL21原核表达菌种中，诱导表达后，镍柱亲和层析法获得纯化的ZHPV16E7:127-GrB和Zwt-GrB蛋白经过SDS-PAGE电泳和Western blot法分析鉴定。⑦细胞免疫荧光法鉴定Affibody-GrB融合蛋白的靶向HPV16E7阳性宫颈癌细胞的结合特性：用ZHPV16E7:127-GrB和对照蛋白Zwt-GrB孵育TC-1细胞（HPV16E7+）和人宫颈癌Siha细胞（HPV16+），用Hela229细胞（HPV18+， HPV16E7-）和人黑色素瘤A-375细胞（HPV18-，HPV16E7-）作为对照细胞株。固定细胞做免疫荧光，鉴定Affibody-GrB蛋白在上述四种细胞中的结合情况。⑨将ZHPV16E7:127-GrB蛋白加入到TC-1细胞和Siha细胞，计算IC50；将ZHPV16E7:127-GrB蛋白、Zwt-GrB蛋白、ZHPV16E7:127蛋白、Zwt蛋白加入到TC-1细胞和Siha细胞、Hela229细胞和A375细胞中，CCK8法比较各蛋白对不同细胞杀伤作用的差异。⑩为确定最适治疗剂量，用ZHPV16E7:127-GrB蛋白1ug/g、4ug/g、8ug/g，尾静脉注射入宫颈癌移植瘤模型小鼠体内，记录在体肿瘤大小，绘制肿瘤生长曲线。治疗结束后，处死小鼠，取肿瘤组织称重，统计分析，比较剂不同浓度肿瘤生长抑制作用。按照最适治疗剂量，将ZHPV16E7:127-GrB蛋白、Zwt-GrB蛋白、ZHPV16E7:127蛋白、Zwt蛋白以及PBS经尾静脉注射入宫颈癌移植瘤小鼠体内，同法比较各治疗组肿瘤抑制作用。 结果：⑴pET32a-GrB重组质粒构建成功，经双酶切鉴定目的片段与理论值大小一致。经SDS-PAGE电泳和Western blot法鉴定，获得的重组GrB蛋白分子量大小为48KDa左右，与理论分子量大小相符。⑵ELISA法检测结果显示，小鼠在第6周可产生GrB特异性多克隆抗体；经免疫斑点法结果证明该多克隆抗体可特异性识别重组的GrB蛋白和天然的GrB蛋白，可用于后续实验中GrB的检测用抗体。⑶pET21a(+)/ZHPV16E7:127-GrB重组质粒和pET21a(+)/Zwt-GrB重组质粒构建成功，经EcoR I和XhoI双酶切鉴定后，酶切片段大小与理论值相符。⑷SDS-PAGE电泳和Western blot结果显示，制备的ZHPV16E7:127-GrB重组蛋白和Zwt-GrB重组蛋白分子量约为34 kDa，与理论分子量大小一致。⑸间接细胞免疫荧光结果显示，ZHPV16E7:127-GrB重组蛋白作用后的TC-1细胞（HPV16E7+）和Siha细胞（HPV16E7+）在细胞膜和细胞胞浆内可见绿色荧光团块，而Hela229细胞（HPV18+，HPV16E7-）和A-375细胞（HPV-）均未见明显绿色荧光信号；而Zwt-GrB作用于细胞后，TC-1细胞、Siha细胞、Hela229细胞和A-375细胞均未见明显绿色荧光信号。⑹ZHPV16E7:127-GrB融合蛋白对HPV16E7阳性表达的TC-1细胞、Siha细胞有靶向杀伤作用，而对HPV16E7阴性表达的Hela229细胞和A375细胞无明显杀伤作用；在TC-1细胞中IC50为3.06±0.34μM，在Siha细胞中IC50分别为2.52±0.21μM。而对照蛋白Zwt-GrB蛋白对上述四个细胞均无明显杀伤作用。⑺同等剂量下，ZHPV16E7:127-GrB融合蛋白与ZHPV16E7:127蛋白对HPV16E7阳性表达的细胞有靶向杀伤作用，而Zwt-GrB融合蛋白蛋白和Zwt蛋白则无靶向杀伤作用，且ZHPV16E7:127-GrB融合蛋白比ZHPV16E7:127蛋白靶向杀伤作用更强，差异具有统计学意义。⑻TC-1细胞C57BL/6小鼠宫颈癌移植瘤模型建立成功，肿瘤组织的DNA通过PCR法可检测到HPV16E7的基因全长片段。⑼经SDS-PAGE电泳鉴定，成功标记Dylight755近红外荧光素染料的Dy755-ZHPV16E7:127-GrB和Dy755-Zwt-GrB，经尾静脉注射TC-1移植瘤小鼠体内12h后，各脏器近红外成像结果显示：Dy-ZHPV16E7:127-GrB在肿瘤组织部位有高亮的红色信号,而Dy755-Zwt-GrB在肿瘤部位无高亮的红色信号。⑽根据ZHPV16E7:127-GrB不同剂量组的治疗结果，最终确定最适治疗浓度为8ug/g。⑾经统计学分析比较结果显示，ZHPV16E7:127-GrB融合蛋白与ZHPV16E7:127蛋白均有治疗TC-1移植瘤小鼠的作用，其中ZHPV16E7:127-GrB融合蛋白对肿瘤生长抑制作用更佳。治疗结束后，瘤体体积：ZHPV16E7:127-GrB组为2091±371.4mm3， ZHPV16E7:127组为2915±494.2mm3差异具有统计学意义。瘤体重量：ZHPV16E7:127-GrB组为2.35±0.42g，ZHPV16E7:127组为3.15±0.70g，差异具有统计学意义。 结论：①成功制备了颗粒酶B重组蛋白及其小鼠多克隆抗体血清。②成功构建了pET21a(+)/ZHPV16E7:127-GrB重组质粒和pET21a(+)/Zwt-GrB重组质粒，经原核体系表达纯化后，获得了纯化的ZHPV16E7:127-GrB融合蛋白和Zwt-GrB融合蛋白。③细胞免疫荧光结果显示，ZHPV16E7:127-GrB融合蛋白对HPV16E7阳性的TC-1细胞和Siha细胞有靶向结合作用。④CCK-8细胞毒性实验结果ZHPV16E7:127-GrB融合蛋白和ZHPV16E7:127对HPV16E7阳性的TC-1细胞和Siha细胞均有靶向杀伤作用，且ZHPV16E7:127-GrB融合蛋白杀伤作用更强。⑤成功建立了TC-1细胞C57BL/6小鼠宫颈癌移植瘤模型。⑥Dy-ZHPV16E7:127-GrB和Dy-Zwt-GrB荧光标记蛋白成功，小鼠各脏器近红外成像结果显示 Dy-ZHPV16E7:127-GrB能在体内靶向结合HPV16E7阳性的TC-1移植瘤。⑦ZHPV16E7:127-GrB融合蛋白与ZHPV16E7:127均有抑制HPV16E7阳性的TC-1移植瘤生长的作用，而且ZHPV16E7:127-GrB融合蛋白抑瘤作用更强。