骨软骨病（osteochondrosis,OC）是以软骨内骨化发生局灶性紊乱为特征的软骨疾病。通常引起人和动物关节疼痛和功能障碍等临床症状。OC患者初期临床症状不明显,导致其早期诊断困难。发展到中后期却治疗困难。关于OC的病因学的研究集中在缺血性生长软骨损伤,主要表现为细胞大量坏死或凋亡,软骨基质胶原和蛋白聚糖降低。然而,这种基质的主要成分和微观结构的变化规律还不明确,引起这种病变的潜在生物学机制也还不清楚。目前大多数关于OC的研究集中在手术切除的骨软骨碎片的组织学变化,以探讨其发病机制。然而,这些处于疾病后期的软骨碎片不能代表原发性OC疾病特征。犬和人OC的发生存在着高度相似性,包括临床表现、好发部位和影像学的改变以及晚期病变的组织学表现,表明他们可能有潜在共同的发病机制。因此,本研究旨在建立犬早期缺血性骨软骨病的基础上,探索其发生的潜在机制,有助于寻找动物和人OC发病早期的诊断生物标志物和新的防治策略。1.缺血诱导犬骨软骨病人和动物的软骨管内血管供应存在于骺生长软骨发育的早期阶段的有限时间内。在生长过程中,位于软骨管中段和远端的软骨管血管随着骨化前沿的推进与软骨下骨的血管形成吻合。当血管吻合发生紊乱时,软骨内骨化不能正常进行,从而导致骨软骨病的发生。软骨管血管的供血障碍在OC发生中起重要作用。因此,研究人员常通过阻断骺生长软骨的血液供应,诱导OC的发生。诱导性生长软骨缺血方法取决于软骨管血管的走向。基于本实验室前期的犬微血管灌注结果,我们发现幼犬股骨髁软骨管血管比滑车软骨管血管长、密度小;而股骨内侧髁软骨管血管比外侧髁软骨管血管长、密度小且分支较少。因此,与股骨滑车和外侧髁相比,犬股骨内侧髁是诱发缺血性软骨损伤的合适部位。本研究于犬股骨内侧髁的远轴侧行全层软骨切除,阻断软骨膜源血供以诱导OC,对侧肢内侧髁做健康对照;术前及术后6、10、20和30 d,分别进行X线影像学检查,评估骺生长软骨的钙化情况;术后6和30 d,分别随机选取6只犬,手术采集膝关节股骨髁软骨组织,采用HE染色、番红固绿染色和甲苯胺蓝染色,对其进行组织学评估;TUNEL染色检测软骨细胞凋亡情况;扫描电镜观察软骨胶原微观形态变化;拉曼光谱学检测软骨组成成分变化。结果显示:术后6、10、20与30 d,膝关节X影像学检查可见OC组犬的股骨远端内侧髁局部缺损随时间的增加而显著降低。术后6 d软骨的组织学观察,OC组出现了典型的缺血性软骨坏死病变,坏死软骨管内血管完整性缺失,软骨管周围部分软骨细胞核消失或胞核胞浆浓缩、胞浆呈嗜酸性等细胞变化;番红固绿及甲苯胺蓝染色显示软骨基质染色变浅,在坏死软骨管周围区域表现更为明显;软骨中间层与深层区软骨细胞出现大量凋亡。术后30 d,软骨细胞与软骨基质的病变更为显著;软骨细胞凋亡从深层区逐渐进展到浅层区;扫描电镜观察到软骨基质胶原出现大量紊乱;拉曼光谱主要组成成分分析结果显示,OC组软骨中蛋白聚糖与胶原相关峰的病变主要集中在中间层与深层。可见软骨细胞凋亡与基质紊乱诱导了OC的发生。2.基于Label free蛋白组学技术的犬骨软骨病差异表达蛋白分析在人与动物的正常生长板软骨和/或骺软骨中,软骨管随机体生长与发育会发生生理性退化。主要表现为软骨管血管退化、消失,小管间充质细胞分化为软骨细胞,最终小管被基质填充,但邻近的软骨细胞未出现异常。病理状态下,早期缺血性OC主要表现为软骨管周围细胞坏死（或凋亡）以及基质的紊乱,可发展为剥脱性骨软骨病（osteochondrosis dissecans,OCD）,也可自愈。这说明生长板软骨中特定的生物学物质可能参与了缺血性OC的发生与发展的调节。本研究应用蛋白质组学技术寻找差异表达蛋白,以探索骨软骨病潜在的分子生物学机制。术后30 d,本研究对OC组和对照组的骺生长软骨相近部位进行全层软骨采样（约3 mm）,采用Label free蛋白组学技术对软骨样本进行差异表达蛋白分析。使用ELISA方法对蛋白质组学的结果进行了验证。对照组与OC组共获取1369种蛋白,对鉴定到的蛋白进行差异表达筛选,OC组与对照组相比,共获得差异蛋白78种,其中显著上调差异蛋白31种,显著下调差异蛋白47种。ELISA验证结果与蛋白组学测序结果高度一致。部分差异蛋白（Htr A1、POSTN、S100A4、IGFBP5、PEDF、ALP和FⅩⅢ等）参与了细胞外基质紊乱的调节。Htr A1、S100A4和Fis等蛋白参与了细胞凋亡。其中,OC软骨中的Htr A1（一种分泌型丝氨酸蛋白酶）水平显著升高。据报道,Htr A1参与细胞外基质的降解,同时调控细胞凋亡。因此,我们推测Htr A1可能通过诱导软骨细胞凋亡与基质紊乱在OC疾病发生中发挥重要作用。3.Htr A1在骨软骨病发生中的作用本试验分离原代犬的生长板软骨细胞,并用免疫荧光进行鉴定。构建了Htr A1过表达质粒pc DNA3.1（+）-Htr A1。使用不同剂量Htr A1过表达质粒（1、3和6μg/m L）转染犬的原代软骨细胞。流式细胞术检测Htr A1过表达诱导软骨细胞凋亡变化;基因和蛋白水平检测与凋亡相关的XIAP/caspase 9/caspase 3信号通路的变化;检测细胞外基质主要组成成分（collagen II和aggrecan）和基质金属蛋白酶（ADAMTS4和ADAMTS5）基因的表达。培养骺生长板软骨外植体,不同剂量Htr A1重组蛋白组（0.1、1和5μg/m L）作用软骨外植体24 h,进行HE染色、番红固绿染色和甲苯胺蓝染色组织学评估;扫描电镜观察软骨胶原微观形态变化;拉曼光谱学检测软骨组成成分变化;检测细胞凋亡和基质紊乱相关基因与蛋白表达的变化。这些研究确定Htr A1在诱导骨软骨细胞凋亡和基质紊乱中的作用,阐明OC发生发展的分子生物学机制。原代软骨细胞培养试验结果显示,不同剂量过表达Htr A1（1、3和6μg/m L）均显著诱导了软骨细胞凋亡,呈剂量依赖性;过表达Htr A1通过激活XIAP/caspase9/caspase 3信号通路诱导了软骨细胞凋亡;过表达Htr A1显著升高了ADAMTS4和ADAMTS5基因的表达,显著降低了细胞外基质主要组成成分（collagen II和aggrecan）基因和蛋白的表达。表明过表达Htr A1可以诱导软骨细胞凋亡与细胞外基质紊乱。软骨外植体研究表明,中剂量和高剂量的重组蛋白Htr A1（1和5μg/m L）)可诱导软骨OC样病变,且呈剂量依赖性。外植体组织学分析显示,中剂量和高剂量Htr A1重组蛋白组中可观察到软骨管和周围软骨细胞大量坏死。同时,软骨外植体组织基质染色较浅,在坏死软骨管周围区域尤为明显。扫描电镜观察显示,Htr A1重组蛋白组的全层软骨（浅层、中间层和深层）胶原分布均出现一定程度紊乱,甚至有明显的断裂现象。这与前一部分中OC软骨中间层与深层的胶原微观形态学变化十分相似。拉曼光谱技术检测到Htr A1重组蛋白处理组软骨主要成分蛋白聚糖和胶原的降低。中剂量和高剂量的重组蛋白Htr A1显著降低了软骨外植体基质相关蛋白collagen II和aggrecan的表达。这些试验证实,异常升高的Htr A1可诱导软骨细胞凋亡和基质紊乱,进而促进OC的发生。综上所述,本研究通过阻断犬股骨远端骺生长软骨的局部血液供应,成功地诱导早期缺血性骨软骨病的发生。应用Label free蛋白质组学技术寻找到生长板软骨中特定的生物学物质Htr A1。通过原代软骨细胞与生长板软骨外植体培养,最终确定了Htr A1在诱导软骨细胞凋亡和基质（胶原和蛋白聚糖）发生紊乱中的作用,阐明OC发生发展的分子生物学机制。