实时监控细胞内生物分子的浓度变化和分布情况对于研究其生理和病理功能、鉴定疾病生物标志物以及疾病的早期诊断具有非常重要的意义。基于荧光探针的荧光成像技术因具有灵敏度高、能够实现时空分辨成像、对活细胞和组织损伤小等优点,已成为监测细胞内生物分子的强有力研究工具。然而,传统的荧光探针进入细胞的低效率制约着其在细胞内的应用。同时,目前的荧光分析技术大都基于单光子荧光探针实现,其具有一些内在的缺点,比如光漂白效应、细胞或组织自身荧光干扰以及穿透深度浅等。基于双光子荧光探针的双光子成像技术是利用频率及能量较低的（波长较长）的双光子作为激发光源的一种新技术,它能够减少光散射,降低生物自身背景荧光的干扰,实现深层组织的长时间观测以及提供更好的三维空间定位能力,减少对组织的损伤。这些优点使得双光子荧光探针更适合用于复杂生物体系的研究。功能核酸主要包括两大类具有特异性分子识别功能的核酸分子,一类是具有类似于蛋白酶的催化活性、特异性依赖辅助因子而发挥催化作用的分子,称为脱氧核酶（DNAzymes）;另一类是能够像抗体一样特异性识别目标物包括金属离子、小分子、药物、蛋白甚至是整个细胞的核酸分子,称为核酸适配体（Aptamers）。功能核酸具有结合力强、选择性好、靶标范围广、生物相容性好、易合成和易功能化修饰等优点;因此,功能核酸的出现为构建用于复杂生物体系的荧光探针提供了新的分子识别工具。纳米材料,比如金纳米颗粒、量子点、上转换纳米颗粒、DNA纳米材料、介孔二氧化硅以及二氧化锰纳米片等具有独特的光学性质、较高的细胞膜穿透能力、优良的生物相容性以及较大的负载能力。同时,由于纳米技术的飞速发展,纳米材料的合成和表征技术已取得了巨大的进展。因此结合功能核酸和纳米技术构建的荧光纳米探针在复杂生物体系研究中具有广阔的应用前景。为了解决现有荧光探针生物稳定性差、膜穿透能力弱、成像效果不佳等导致其难以用于复杂生物体系的问题,本论文利用双光子荧光成像技术和纳米材料的优势,将核酸分子工程技术与纳米技术结合,开发了一系列适于复杂生物体系的功能核酸荧光纳米探针。具体内容如下:（1）在第2章中,基于锆离子与两个磷酸根的特异性配位能力,我们构建了一种通过目标诱导形成分子信标的荧光增强型探针用于锆离子的检测。由于分子信标独特的茎-环结构以及γ-环糊精的放大作用,使得该探针具有较低的检测下限。进一步将该探针用于实际样品湘江水中锆离子的检测,结果令人满意。（2）在第3章中,基于DNA树枝状纳米结构作为一种高效的运输载体,我们构建了一种纳米探针用于功能核酸的细胞输送和细胞内生物分子的原位实时检测。该纳米探针在细胞内维持了DNA酶原有的催化活性和核酸适配体对目标物的特异性识别能力。同时,这种DNA树枝状纳米载体具有较好的生物相容性、较高的细胞膜穿透能力以及较高的生物稳定性,因此,该纳米探针在生物医学诊断和治疗领域拥有广阔的应用前景。（3）目前,基于荧光探针的荧光成像技术大多是通过单光子激发实现的,不可避免地会出现光漂白效应、细胞或组织自身荧光干扰以及组织穿透深度浅等问题。在第4章中,基于双光子成像技术能够实现深层组织的长时间观测、背景荧光干扰小、光散射小以及对样品损伤小等优点,我们构建了一种荧光增强型纳米探针用于谷胱甘肽的检测。结合双光子成像技术,该探针可成功用于监测细胞和组织内谷胱甘肽含量的变化,证实了该探针在生物系统中的实际应用价值。（4）基于双光子成像技术的独特优势,以及核酸适配体特异性结合目标细胞的能力,在第5章中,我们构建了一种多功能纳米探针用于高对比度的双模式细胞成像和肿瘤的诊疗。在该纳米探针中,双光子介孔硅作为信号报告单元和纳米载体,二氧化锰纳米片作为门控分子、双光子荧光猝灭剂以及核磁共振成像的增强因子。当该探针在核酸适配体介导下进入目标细胞后,细胞内的谷胱甘肽将MnO₂还原成Mn2+,从而实现了细胞内高对比度的双光子成像和核磁共振成像。同时,载入纳米颗粒中的DOX和Ce6被释放出来,对癌细胞实现化疗和光动力学治疗,并展示出显著的协同治疗效果。