P-gp 在卵巢癌紫杉醇耐药细胞株线粒体中的定位及其功能表达

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目的:探究P-gp在卵巢癌紫杉醇耐药细胞株线粒体膜上是否表达及其转运功能,为进一步研究线粒体膜上的P-gp与卵巢癌细胞耐药及抗凋亡的关系提供理论支持。  方法:  1.用MTT法检测卵巢癌亲本株(A2780)及其紫杉醇耐药株(A2780/T)的紫杉醇IC50值,明确A2780/T的耐药指数。  2.用密度梯度离心法提取A2780和A2780/T细胞线粒体,Western Blotting(WB)检测胞浆和线粒体标志蛋白HSP60和细胞色素C,评估提取的线粒体纯度;透射电镜观察线粒体形态及完整性;JC-1试剂盒检测线粒体膜电位,评估线粒体活性。  3.应用Western Blotting(WB)法检测细胞总蛋白和线粒体中P-gp的表达。  4.应用免疫细胞化学(ICC)检测P-gp在A2780和A2780/T细胞中的表达及其亚细胞定位。  5.应用细胞免疫荧光结合激光共聚焦成像技术检测A2780和A2780/T细胞中P-gp与线粒体的共定位。  6.应用流式细胞术检测A2780和A2780/T线粒体对罗丹明(Rho123)的外排作用,并用环孢素A(CsA)抑制P-gp功能,研究线粒体外排罗丹明的作用是否依赖于P-gp。  结果:  1. A2780、A2780/T细胞的紫杉醇IC50分别为0.042μM和2.213μM。A2780/T的耐药指数为52.69。  2. WB结果显示HSP60和细胞色素C分别特异性表达于胞浆和线粒体,提取的线粒体纯度较高;电子透射电镜观察到提取的线粒体有完整的结构,线粒体内膜和外膜清晰可见,并且看到线粒体的嵴结构完整;JC-1检测提示提取的线粒体膜电位较高,活性较好。  3. WB显示P-gp在A2780/T细胞和线粒体中表达呈阳性,在A2780细胞和线粒体中不表达。  4. ICC结果提示P-gp在A2780/T细胞的胞膜、胞浆和胞核中都有表达,而在A2780细胞中没有表达。  5.激光共聚焦显微镜下看到A2780/T细胞株中带有红色荧光的线粒体和带有绿色荧光的P-gp共定位而产生了橘色的荧光,而在A2780细胞中没有观察到线粒体和P-gp的共定位。  6. A2780/T和A2780细胞线粒体罗丹明外排率分别为43.34%和2.07%。且环孢素A可显著抑制A2780/T线粒体外排罗丹明的功能。  结论:P-gp在紫杉醇耐药卵巢癌细胞的线粒体上高表达,并且发挥外排药物的功能。
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