论文部分内容阅读
近年来,野生冬虫夏草资源的有限性与逐年增长的市场需求矛盾日益突出,利用液体发酵方法生产冬虫夏草菌丝体和胞外多糖具有周期短、产量高、质量稳定等优点,是工业生产菌丝体和胞外多糖等冬虫夏草替代品的高效、节能方式。不同菌株对培养条件的要求差异很大,经过优化培养可以提高菌丝体和胞外多糖的产量,这些胞外多糖一般都具有潜在的生物学活性。本文对一株经多年驯化的冬虫夏草Hirsutella sinensis G67菌株胞外多糖和菌丝体的高通量发酵条件及其多糖的构效关系进行了研究。确定了该菌株的液体发酵条件及多糖提取工艺,并采用分级醇沉的方法分别获得三个胞内多糖(IPS)片段和三个胞外多糖(EPS)片段。用高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)、气相色谱法(GC)、红外光谱扫描法(FTIR)及化学方法分析了不同多糖片段的基本结构特性,评价了胞外多糖和胞内多糖的体外吸湿保湿性能、抗氧化活性和抑菌活性,在此基础上进一步通过方差分析、相关性分析和线性分析等统计学方法分析了多糖基本性质与活性的关系。主要研究结果如下：1.利用单因素和响应面试验优化Hirsutella sinensis G67高通量发酵的营养成分和培养条件。最佳培养基组成为：蔗糖29.05 g/L,酵母膏5.31 g/L,NaNO3 1.33 g/L, K2HPO42.10g/L,MgSO4·7H2O 0.78 g/L,添加200 g/L土豆(煮汁)；最适发酵条件为：初始pH 6.0,装液量100mL/250mL,接种量10%,培养温度25℃。上述条件下培养72 h,胞外多糖和菌丝体产量分别达到5.87 g/L和15.92g/L(干重)。30 L全自动发酵罐试验中发酵周期缩短至60 h, EPS产量和生物量分别为5.82 g/L和15.90 g/L,表明该菌株的发酵能够实现放大,有望应用于工业化生产。2.多糖提取工艺的确定。胞外多糖的提取：将发酵液浓缩至原体积的1/6,pH调节至8.0；胞内多糖的最佳提取工艺：菌丝体冻融后加8倍水(质量比),100 ℃、60min沸水浸提一次,浸提液浓缩6倍,pH调节至8.0。用1倍、2倍、4倍乙醇依次对多糖进行分级醇沉,分别得到3个胞外多糖片段(EPS-1,EPS-2,EPS-3)和3个胞内多糖片段(IPS-1,IPS-2,IPS-3),分别以EPS-3和IPS-3的百分含量最高。胞外多糖和胞内多糖的提取率分别为89.7%和17.5%(以干重计)。3.多糖基本性质的测定及对比。低乙醇倍数沉降所得多糖(EPS-1和IPS-1)的蛋白含量较高(19.86%和33.97%),糖含量相对较低(70.71%和52.71%),分子量较大((43.0 kDa和23.1 kDa)；而高乙醇倍数沉降所得多糖(EPS-3和IPS-3)的糖含量(92.64%和85.55%)则相对较高,蛋白含量降低(2.00%和1.90%),分子量相对较小(4.7 kDa和10.4 kDa)。不同乙醇倍数沉降所得多糖的单糖组分也不同,EPS-1、EPS-2、IPS-1和IPS-2由甘露糖、半乳糖和葡萄糖组成,而EPS-3和IPS-3则不含半乳糖；各多糖片段的单糖组成比例也存在一定差异,随着所用乙醇倍数的增加,所得胞内多糖的甘露糖含量逐渐下降(由59.0%下降至27.2%),而葡萄糖含量逐渐升高(由8.5%上升至72.8%)。多糖中存在少量的糖醛酸,不同多糖片段之间的含量差异不明显。红外光谱分析也表明不同多糖片段结构基本一致,相似性很高。4.多糖体外生物学活性评价。对Hirsutella sinensis G67液体发酵多糖的吸湿保湿性能、抗氧化活性和抑菌活性分别进行了评价：胞内多糖和胞外多糖具有很好的吸湿保湿性能,保湿性能仅次于透明质酸,而远远优于甘油；多糖对羟自由基和超氧自由基有一定的清除能力,并且能很好的螯合亚铁离子,呈现良好的量效关系；另外,多糖对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌均有广谱抑菌性,对白色念珠菌也有较好的抑制作用。5.多糖生物学活性的构效分析。多糖性质对活性的影响明显：分子量较大的多糖片段保湿性能更好,而分子量较小的多糖吸湿性能更强；甘露糖含量较高的多糖片段对·OH自由基的清除作用更强,半乳糖含量高的多糖片段对·O2-自由基的清除能力更好,分子量较小的多糖片段则具有更强的亚铁离子螯合能力。