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【研究背景】骨肉瘤是一类好发于青少年具有高度恶性的骨肿瘤。骨肉瘤具有高转移性,最易转移的器官是肺。在没有化疗的时代,超过85%的截肢后患者发生了转移。随着新辅助化疗的提出,结合保肢技术的发展,目前对于骨肉瘤治疗的5年生存率可以提高到60%左右。虽然化疗在骨肉瘤治疗中发挥了重要作用,但是该方法总体有效率为60%左右。目前骨肉瘤新辅助化疗的药物为顺铂(CDDP),阿霉素(ADM),甲氨蝶呤(MTX)和异环磷酰胺(IFO)。顺铂是目前广泛应用抗肿瘤药物之一。伴随着治疗过程的延长,越来越多的患者发展为对于化疗的耐药,甚至多药耐药,导致治疗的失败。顺铂耐药已经成为骨肉瘤治疗过程中的一个非常棘手的问题。耐药产生的机制十分复杂,至今仍未完全阐明。近年来,随着mi RNA的发现,大量的研究证明这类内源性非编码小分子RNA,可以调控超过30%的人类的基因转录后表达,从而广泛参与细胞的各种信号途径。同样,有研究表明耐药机制发生发展过程中的一些相关蛋白表达也受mi RNA的调控,因此探寻这种上游调控机制,研究mi RNA分子不仅可确定骨肉瘤的一种生物标志物,而且还可以作为骨肉瘤治疗的靶点。【目的】建立一种骨肉瘤细胞多药耐药模型,筛选与骨肉瘤耐药相关的mi RNA分子,研究mi RNA参与骨肉瘤耐药的分子机制。为临床治疗骨肉瘤耐药提供理论和实验依据。【方法】1.在体外采用逐步增加剂量冲击诱导的方法建立人骨肉瘤耐药细胞系,SOSP-9607/CDDP。2.采用形态学方法,测定生长曲线计算耐药细胞系倍增时间,MTT方法检测细胞对于化疗药物的耐药性,Transwell实验检测细胞的侵袭能力,流式细胞仪技术检测细胞周期,RT-PCR技术检测耐药相关基因m RNA的表达,免疫细胞化学和western blot方法检测MRP1的表达,从而分析耐药细胞系SOSP-9607/CDDP的生物学特性。3.采用Affymetrix mi RNA 2.0芯片筛选耐药细胞SOSP-9607/CDDP和亲本细胞SOSP-9607中mi RNA表达谱的差异。4.采用荧光实时定量PCR技术验证芯片筛选出的耐药细胞SOSP-9607/CDDP和亲本细胞SOSP-9607中差异表达的5个micro RNAs。5.运用生物信息学方法分析芯片结果,预测参与骨肉瘤细胞耐药的靶基因,发现BAK1的3’-UTR和mi R-25的种子序列存在结合位点。6.使用瞬时转染的方法将mi R-25转染入骨肉瘤亲本细胞SOSP-9607上调mi R-25的表达,将anti-mi R-25转染入耐药细胞SOSP-9607/CDDP下调mi R-25的表达。7.采用RT-PCR、western blot、流式细胞仪检测细胞凋亡、体外药物敏感实验等方法分析转染mi RNA分子后骨肉瘤细胞功能改变。8.使用pmir Glo-vector荧光素酶报告系统验证mi R-25和BAK1的靶向关系。【结果】1.历时12个月诱导建立骨肉瘤耐药细胞系SOSP-9607/CDDP,该细胞系行脱药培养、反复冻存后耐药性质稳定。2.形态学上,SOSP-9607/CDDP较其亲本细胞SOSP-9607发生改变。生长曲线显示SOSP-9607/CDDP较其亲本细胞SOSP-9607倍增时间延长,分别是45.11h与29.79 h。细胞周期结果显示耐药细胞SOSP-9607/CDDP在G0/G1期较亲本细胞SOSP-9607增加,在S期较亲本细胞SOSP-9607降低(P<0.05)。两者在G2/M期无明显差异。SOSP-9607/CDDP较其亲本细胞SOSP-9607对顺铂的耐药指数是6.24,同时对CBP,MTX和ADM显示出交叉耐药。Transwell分析检测结果显示SOSP-9607/CDDP较亲本细胞SOSP-9607的侵袭能力增加。相比较亲本细胞SOSP-9607,MRP1,MRP2和GST-πm RNA的表达在SOSP-9607/CDDP细胞中表达增加(P<0.01)。免疫细胞化学染色显示MRP1在耐药细胞中高表达。western blot结果显示MRP1在耐药细胞中高表达。3.与骨肉瘤亲本细胞系SOSP-9607相比,骨肉瘤顺铂耐药细胞系SOSP-9607/CDDP中存在18个差异表达的mi RN As分子,其中,包含11个表达上升的mi RNAs分子(P<0.05)和7个表达下降的mi RNAs(P<0.05)4.荧光实时定量PCR结果显示,mi R-25,-29c,-1290,-194与芯片检测的结果相符合。5.生物信息学方法预测结果显示,BAK1的3’-UTR和mi R-25的种子序列存在结合位点。6.转染mi R-25后,骨肉瘤实验组细胞与对照组细胞相比,BAK1 m RNA的表达水平无明显意义上的差异。在亲本细胞中转染mi R-25前体,BAK1蛋白表达水平具有统计学意义的下降(P<0.05)。在耐药细胞的中转染mi R-25抑制剂,BAK1蛋白表达水平具有统计学意义的上升(P<0.05)。7.在亲本细胞和耐药细胞中分别转染mi R-25前体和抑制剂后,亲本细胞的抗凋亡能力增加(P<0.05),耐药细胞抗凋亡能力降低(P<0.05)。8.采用MTT方法检测转染后的骨肉瘤细胞对于化疗药物的敏感性,结果显示,在亲本细胞中上调mi R-25的表达可增加细胞对于多种化疗药物的半数致死量,产生耐药性。在耐药细胞中下调mi R-25的表达可降低细胞对于多种化疗药物的半数致死量,从而逆转耐药性。9.共转染pre-mi R-25和pmir Glo-BAK1-3’UTR的骨肉瘤实验组的荧光素酶活性具有显著意义的降低(P<0.05),该结果表明mi R-25能够作用于BAK1的3’UTR区域,BAK1为mi R-25的靶基因。【结论】成功建立了骨肉瘤耐药细胞系,SOSP-9607/CDDP,实验证明该细胞系可以作为骨肉瘤耐药分子机制的研究模型。骨肉瘤耐药细胞系中存在多个差异表达的mi RN As分子,这些mi RNAs分子可能参与了骨肉瘤耐药的病理过程。BAK1是mi R-25的直接靶基因,mi R-25有可能通过调控凋亡因子BAK1的表达,从而参与了骨肉瘤耐药过程的发生。