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三七(Panaxnotoginseng)为五加科人参属名贵中药材,其主要活性成分三七总皂苷(Panax notoginseng saponins,PNS)在抗肿瘤、抗氧化、抗衰老等方面有着较强药理活性,在临床上主要用于心脑血管疾病治疗。目前此类活性成分主要从原植物中分离提取获得,对中药资源存在严重依赖。通过合成生物学技术发酵生产或对药用植物进行有效成分提高的定向育种方法,均有利于缓解当前资源压力。然而,清晰的生物合成途径是前者工作的基本前提,因此解析三七皂苷的合成途径显得非常重要。在本研究中,根据三七总皂苷由三萜苷元和糖基供体两部分组成的特征,首先整合人参(Panaxginseng)来源的达玛烯二醇合成酶(SynPgDDS)、原人参二醇合酶(SynPgPPDS)、原人参三醇合酶(SynPgPPTS)和拟南芥(Arabidopsis thaliana)来源的细胞色素P450还原酶(AtCPR1)组成的苷元功能模块PPD-PPT到BY-T3菌株中获得菌株BY-PPT;然后调控酿酒酵母中磷酸葡萄糖变位酶1(PGM1)、a-磷酸葡萄糖变位酶(PGM2)、尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶(UGPI)等功能酶得到能将糖基供给提高8倍的功能模块PGM1-PGM2-UGP1,建立起“即插即用”底盘细胞BY-PPT-GM。在此基础上将功能已知的人参20位UDP-葡萄糖基转移酶基因Pg3-29转入BY-PPT-GM,完成对UGTs“即插即用”鉴定平台的测试。利用上述平台技术,进行三七皂苷生物合成途径的解析。UDP-葡萄糖供给模块PGM 1-PGM2-UGP1首先被转入酿酒酵母B Y-T3中获得B Y-T3-GM。继续整合SynPgDDS、SynPgPPDS、SynPgPPTS和AtCPR1基因,得到可同时生产三萜苷元原人参二醇(Protopanaxadiol,PPD)和原人参三醇(Protopanaxatriol,PPT)的底盘细胞BY-GM-PPT,为三七糖基转移酶功能测试提供基础。将生物信息学分析获得的64个三七来源糖基转移酶基因编号后分别与强启动子pTEFl和终止子CYClt进行标准化组装,获得候选基因表达元件库。将基因表达元件分别转入底盘细胞BY-GM-PPT,测试出Pnl-31可以催化PPD的3位糖基化反应,Pn3-29可以催化PPD和PPT的20位葡萄糖基化反应。将基因Pn1-31与UDP-葡萄糖供给模块同时整合入底盘细胞BY-PPT,得到可生产Rh2的第二代底盘细胞BY-Rh2。将剩余基因表达元件转入BY-Rh2中进行第二轮测试,测试出Pn3-29可以催化Rh2的20位葡萄糖基化合成F2,Pn3-31可以在Rh2的3位糖基化产物基础上再增加一个葡萄糖获得Rg3。将Pn3-29、Pnl-31和Pn3-31三个基因与UDP-葡萄糖供给模块同时整合入底盘细胞BY-PPT,得到可生产Rd的第三代底盘细胞BY-Rd。将剩余基因表达元件转入BY-Rd进行第三轮测试,测试出Pn3-32可以催化Rd合成Rb1。至此成功解析出三七中Rh2、CK、F2、Rg3、Rd和Rb1等皂苷的生物合成网络途径。