马立克氏病（MD）是鸡的一种恶性T淋巴细胞增生性疾病，对养禽业危害极大。开展广西三黄鸡抗MD相关分子遗传学标记的筛选研究，旨在确立相应的分子遗传学标记来促进三黄鸡的抗MD育种工作，以弥补目前依赖疫苗免疫和生物安全为主的MD防制手段的不足。至此，已完成如下主要工作：利用聚合酶链式反应—限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）分析的方法，对120份霞烟鸡B-L BⅡ基因第2外显子的PCR扩增产物采用限制性内切酶AluⅠ、CaiⅠ、CfrⅠ、HinlⅠ、HinfⅠ和RsaⅠ分别进行分析。运用在这6个位点所观测的纯合基因型组合对B-L BⅡ等位基因纯合型鸡只进行初步筛选，并通过进一步的克隆、测序，最终获得B-L BⅡ等位基因纯合型鸡只7羽(其中MD抗性个体5羽，代号分别为：A₁₁、C₂₃、D₈、D₁₂、K₈；易感个体2羽，代号分别为：A₅、B₂₁)。所获得7羽霞烟鸡的序列经与GenBank下载的B²、B⁶、B¹²、B¹⁹、B²¹单倍型B-L BⅡ基因的序列相比较，发现此基因区域碱基替代非常频繁，呈现出丰富的多态性。MD抗性个体A₁₁、C₂₃、D₁₂、K₈间的核苷酸同源性达100％，与B⁶单倍型（中等MD抗性型）核苷酸和氨基酸同源性较高，分别达到98.9％和97.8％；这4羽霞烟鸡在MDV攻毒实验中均具有明显的MD抗性。MD易感个体A₅、B₂₁间的核甘酸同源性达95.5％，与B¹⁹单倍型（MD易感型）核苷酸同源性分别达96.3％和94.8％，氨基酸同源性分别达91.0％和89.9％；这2羽霞烟鸡在MDV攻毒实验中均表现出易感性。MD抗性个体A₁₁、C₂₃、D₁₂、K₈与易感个体A₅、B₂₁的核苷酸同源性仅分别为91.4％和93.3％，氨基酸同源性仅分别为83.1％和85.4％，存在较大的差异。因此，推测MD抗性个体A₁₁、C₂₃、D₁₂、K₈的B-L BⅡ基因序列为具有MD抗性的一个特征序列；MD抗性个体D₈的B-L BⅡ基因序列虽与A₁₁等抗性个体的核苷酸同源性较低，但在MDV攻毒实验中表现出明显的MD抗性，故推测D₈的B-L BⅡ基因序列为具有MD抗性的另一特征序列。而MD易感个体A₅、B₂₁的B-L BⅡ基因序列则推测为两个MD易感的特征序列。应用建立的逆转录酶—聚合酶链式反应（RT-PCR）技术对霞烟鸡GH基因转录子进行扩增，并对目的基因进行TA克隆，经HindⅢ、EcoRⅠ双酶切和测序鉴定，将目的基因片段成功定向亚克隆于pSP72质粒T7启动子下游的多克隆位点，经PCR和HindⅢ、EcoRⅠ双酶切鉴定，采用HindⅢ单酶切pSP72-GH重组质粒得到线性化转录模板DNA，在体外以T7 RNA聚合酶转录合成，成功制备用于进行核糖核酸酶保护实验（RPA）的GH反义RNA探针；采用核糖核酸酶保护技术对MD抗性与易感霞烟鸡个体进行GH基因的mRNA定量表达测定，结果显示MD抗性个体的GH基因表达水平比易感个体低，且二者之间存在明显差异，从而可以初步的把GH基因作为MD抗性选育的分子遗传学标记之一。应用逆转录酶—聚合酶链式反应（RT-PCR）逆转录扩增GH基因、B-F基因和GAPDH基因转录子的cDNA，并将纯化的cDNA亚克隆于pGM-T载体的多克隆位点。重组质粒DNA经PCR和HindⅢ、EcoRⅠ双酶切鉴定及测序分析，证实GH基因、B-F基因和GAPDH基因成功重组到pGM-T载体上。将梯度浓度的GH基因、B-F基因和GAPDH基因重组标准品质粒DNA进行荧光定量PCR，建立标准曲线。经分析显示标准曲线的Ct值与标准品浓度的对数值之间存在良好的线性关系。动力学曲线分析表明，在该反应体系和反应条件下，标准曲线的灵敏度都到达10拷贝／反应。结果表明，实时荧光定量PCR检测GH基因、B-F基因和GAPDH基因表达水平的标准品质粒和标准曲线构建成功。本研究的结果表明，MD抗性鸡与易感鸡间的B-L BⅡ基因序列存在明显的差异；MD抗性鸡与易感鸡在GH基因的表达水平上亦存在明显差异。因此，可以初步的把B-L BⅡ基因和GH基因作为MD抗性选育的分子遗传学标记。此外，本研究还成功构建了实时荧光定量PCR检测GH基因、B-F基因和GAPDH基因表达水平的标准品质粒和标准曲线，为下一步定量检测GH基因和B-F基因在不同MD抗性能力霞烟鸡外周血淋巴白细胞的表达水平奠定了基础。