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木葡聚糖转葡糖苷酶(XET)是一种已经确定的细胞壁松弛因子,具有放松细胞、扩展细胞重要功能。为探讨该酶在木材形成中的功能、表达调控、作用机制及其在基因工程遗传改良中的应用前景,从而为进一步研究基因工程改良树木材性提供理论基础和基因资源。本文以团花树形成层为研究对象,用RACE法和染色体步移法克隆了XET基因,并对其进行了生物信息学分析。主要结果有:
1.用杨树提取法、RNAplant Reagent法提取的团花树RNA很少降解,28S rRNA和18S rRNA条带很清晰,纯化后OD260/OD280的值在1.8~2.0之间,RNA产率可达38.40μg/100mg,可满足RT-PCR反应和RACE实验的要求,为成功克隆团花树相关基因奠定了基础。
2.用试剂盒法和CTAB法可成功提取团花树基因组DNA。用GeneTools软件估计DNA浓度分别为29~117ng/μL和183~243ng/μL。CTAB法提取的基因组DNA质量较好。
3.通过设计简并引物克隆出了团花树XET基因的保守序列,共307bp;用RACE法和染色体步移法分别扩增出XET基因的3’端序列949bp和5’端序列603bp;最后得到了团花树XET基因全长1396bp,包含了一个完整的开放阅读框882bp,编码一个294个氨基酸的蛋白序列。该氨基酸序列与其他物种XET基因的氨基酸序列有较高的同源性,与杨树、拟南芥、石刁柏、荔枝、黄瓜的XET基因的氨基酸序列同源性在60%以上;且该蛋白序列包含与XET基因功能相关的两个结构域,说明所克隆的序列是团花树XET基因序列。
4.对所得XET基因编码蛋白进行了氨基酸组成、疏水性、跨膜区、信号肽、二级结构和三级结构等生物信息学分析。