第一部分大鼠脂肪干细胞与原代皮层神经元分离、培养与鉴定【背景】脂肪干细胞是来源于脂肪组织的成体间充质干细胞的一种,在多种神经疾病,如退行性变、炎性脱髓鞘、卒中等动物疾病模型中发挥了重要的治疗及神经保护作用。因此本研究旨在探索脂肪干细胞参与神经修复的能力及机制。【目的】体外分离、培养稳定传代的脂肪干细胞和成熟的原代皮层神经元细胞。【方法】脂肪干细胞取材于4-6周龄,体重160 g雌性SD大鼠,大鼠腹股沟区的脂肪组织在无菌条件下取出,切碎,I胶原酶在中消化45分钟,等体积完全培养基终止消化,离心后接种于完全培养基中,3天换液一次,7-8天后根据生长情况予以传代处理。原代大鼠皮层神经元取材于胎龄16-17天的SD胎鼠,剥去脑膜,皮层切碎,胰蛋白酶消化消化15分钟,三倍体积的完全培养基终止消化,巴氏吸管吹打,细胞接种于多聚赖氨酸包被的培养皿中,4小时后更换为神经元培养基,3天半量换液一次。【结果】体外培养的脂肪干细胞呈纺锤形,贴壁生长,ADSCs高表达CD44(86.69%)和CD29(98.49%),而不表达造血干细胞标志物CD45、极低表达内皮细胞标志物CD34(8.61%)。体外分离培养的原代神经元可在11天至14天发育成熟,胞体大,突起丰富,细胞间互相连接成网,具有神经元的功能。【结论】体外可培养出稳定传代的脂肪干细胞及具有功能的成熟神经元。第二部分脂肪干细胞体外定向分化为神经元样细胞及其初步功能学鉴定【背景】体外培养的脂肪干细胞可在小分子作用下选择性诱导成为神经元样细胞,在神经疾病的治疗中可能发挥重要的功能。是否具有神经元的形态及功能,能否整合形成新的神经网络因此成为近年来研究的热点。【目的】体外定向诱导脂肪干细胞向神经元样细胞分化并探索其功能。【方法】取稳定传代P3代生长良好的脂肪干细胞分两步进行诱导分化。第一步,在含20 ng/ml EGF,20 ng/ml b FGF-2,2%B27的无血清培养基中诱导脂肪干细胞向神经前体细胞悬浮成球分化。采用免疫荧光染色(Nestin、DCX、MAP2)对诱导前后的细胞进行鉴定。第二步,在含2%B27,50ng/ml BDNF,0.5umol/ml RA,10umol/ml Forskolin的无血清分化培养基中诱导神经前体细胞定向向神经元样细胞贴壁分化。采用免疫荧光染色(Nestin、DCX、MAP2)对不同分化时期的细胞进行鉴定。利用活体细胞荧光标记技术(Dio、FM4-64),对神经元样细胞进行初步功能学探索。利用Sholl analysis软件对不同分化时期的神经元样细胞的类突触复杂度进行定量分析。【结果】脂肪干细胞在b FGF、EGF细胞因子的作用下可悬浮成球生长,类似于神经干细胞的形态,神经球早期高表达干细胞标记物Nestin,不表达神经元的标记物MAP2、DCX。神经前体细胞在RA、Forskolin及神经生长因子(BDNF)的作用下可在体外贴壁生长,进一步定向向神经元分化。随着分化时间延长,形态上胞体逐渐增大,透光度下降,伸出突触并连接成网。神经元样细胞早期表达新生神经元的标记物DCX,后期表达成熟神经元的标记物MAP2。随着分化的时间延长,神经元样细胞的突触复杂度逐渐增加。于14天左右,分化成熟的神经元样细胞初具神经元的功能,在高钾离子浓度的刺激下可释放类突触小泡。【结论】脂肪干细胞可经过二步法体外定向分化为神经元样细胞,分化的神经元样细胞初具神经元的功能。第三部分脂肪干细胞对铁超载的原代皮层神经元的保护作用分子机制研究【背景】脂肪干细胞除了具有自我更新、多向分化的潜能外,还兼具分泌多种生物活性的细胞因子及参与机体免疫调节的重要功能。铁凋亡是多种疾病模型细胞程序性死亡的重要途径,如卒中、神经退行性变等。探索脂肪干细胞对铁超载的神经元是否具有保护作用及其具体机制成为提高脂肪干细胞的疗效的新靶点。【目的】阐明脂肪干细胞对铁超载的神经元的保护作用及具体机制。【方法】选取0.4μm直径的Transwell培养皿建立脂肪干细胞与原代皮层神经元的间接共培养体系。硫酸亚铁(Fe SO4)处理原代皮层神经元模拟脑出血后继发性铁离子超载的体外模型,MTT实验确定最佳Fe SO4浓度。根据实验目的将皮层神经元分为4组,正常对照组(Vehicle组)、ADSCs共培养空白组(ADSCs组)、亚铁离子处理组(Fe SO4组)、ADSCs治疗组(ADSCs+Fe SO4组)。流式细胞学Annexin V/PI双标,检测不同组别的神经元细胞的凋亡率。利用丙二醛(MDA)试剂盒测定脂质过氧化产物MDA的浓度。ELISA检测不同组别培养基中胰岛素样生长因子-1的含量。利用一氧化氮合酶试剂盒测定t NOS和i NOS的活性。Western-Blot技术测定皮层神经元中PI3K/Akt、Nrf2/HO-1、Bax/Bcl-2相关信号通路的蛋白表达水平。利用免疫荧光染色技术测定脂肪干细胞中HO-1表达水平。【结果】Fe SO4对皮层神经元的毒性作用呈浓度依赖性,8μM是最佳Fe SO4浓度。与Vehicle、ADSCs组相比,Fe SO4组神经元中的MDA含量、t NOS、i NOS的活性明显升高,而ADSCs+Fe SO4组MDA含量、t NOS、i NOS的活性显著低于Fe SO4组。ADSCs组及ADSCs+Fe SO4组IGF-1水平均显著高于Vehicle组及Fe SO4组。流式细胞学结果显示,Vehicle、ADSCs组细胞有少许细胞凋亡,凋亡率约16.9%左右,Fe SO4组神经元凋亡率明显上升,达27.6%,而ADSCs+Fe SO4组凋亡率下降至22.4%。WB结果显示,正常情况下,Vehicle、ADSCs组表达极低含量p-PI3K、Nrf2、HO-1,表达一定含量的Akt、p-Akt、Bax、Bcl2以发挥正常生理作用。Fe SO4组的神经元中p-PI3k、p-Akt、Bcl2表达量显著下降,Nrf2、HO-1表达显著升高。与Fe SO4组相比,ADSCs+Fe SO4组p-PI3k、p-Akt、Bcl2表达量显著升高而Nrf2、HO-1表达量进一步显著升高。上室ADSCs中,Fe SO4处理后HO-1表达量显著升高(*p<0.05或者**p<0.01)。【结论】脂肪干细胞与皮层神经元共培养可以降低Fe SO4引起的脂质过氧化产物的水平,减少神经元的凋亡,降低NOS的活性,下调炎症水平。具体机制可能是脂肪干细胞通过旁分泌IGF-1激活PI3K/Akt信号通路促进神经元存活,激活氧化应激通路Nrf2/HO-1发挥抗炎作用,激活线粒体凋亡途径Bax/Bcl-2抗凋亡相关蛋白的表达,减少神经元的凋亡。