细胞缝隙连接通讯(Gap junctional intercellular communication, GJIC)是哺乳动物细胞间普遍存在的一种通讯方式,在细胞增殖、分化、凋亡、死亡等生理过程中具有重要作用。镉是一种重要的工业和环境污染物,危害人和动物的健康,肝脏是镉的重要靶器官之一。镉不仅引起肝细胞凋亡,还能抑制肝细胞GJIC,影响细胞缝隙连接蛋白的表达和分布,但GJIC在镉暴露肝脏损伤过程中的作用机制尚不明确。本研究在体外用2.5、10 μmol/L镉和50 μmol/L红景天苷(Salidroside, Sal)单独或联合作用BRL 3A细胞6、12h；并选择80-100g雌性SD大鼠,50 mg/L镉自由饮水,35 mg/kg B.W. Sal每天灌胃一次,单独或联合处理12周,建立动物模型。通过细胞生物学和分子生物学方法,探讨镉致大鼠肝脏损伤过程中GJIC的变化以及其在钙离子通路、MAPK通路以及自噬调控镉致肝细胞毒性损伤中的作用机制,并阐明Sal在上述过程中的保护作用。为揭示镉致肝脏毒性损伤的分子机制提供依据。1、镉致大鼠肝细胞损伤及Sal的保护作用为了研究镉对大鼠肝细胞毒性的影响,本试验通过体内、体外试验检测镉及Sal对SD大鼠细胞活力、细胞形态、细胞指数、肝脏脏器指数、肝脏组织病理学变化和肝细胞超微结构的变化。体外试验结果表明,不同剂量镉(2.5、5、10、20 μmol/L)暴露致BRL 3A细胞皱缩、细胞间隙增大、死细胞增多、细胞核收缩、变形、破裂,核染色质浓缩成点状分布、细胞存活率下降、细胞指数(CI)下降,并且呈明显的时间-剂量效应。不同浓度(25、50、100 μmol/L) Sal对CI无显著影响,提示Sal在所选浓度范围内基本无细胞毒性。染镉组与50 μmol/L Sal联合处理明显减轻镉导致的CI下降速度。这一结果表明,50 μmol/L Sal对2.5 μmol/L Cd和10 μmol/L Cd导致的细胞毒性有保护作用。体内试验结果表明,染镉组(50 mg/kg B.W.)大鼠肝脏脂肪变性,肝细胞排列紊乱,中央静脉淤血。Cd与Sal联合处理组大鼠肝脏脂肪变性相对于染镉组有明显好转。透射电镜观察肝细胞超微结构发现,染镉组的肝细胞核染色质明显收缩,细胞核固缩、浓染；线粒体肿胀,线粒体嵴模糊、断裂甚至崩解,部分形成空泡。Sal可明显减轻Cd对大鼠肝细胞线粒体和细胞核的损伤。2、镉对大鼠GJIC的影响为了研究镉对GJIC的影响,通过染料划痕示踪法检测GJIC,免疫印迹法检测连接蛋白Cx43、Cx32,实时定量PCR检测Cx43、Cx32相关基因表达,RTCA检测细胞指数,免疫荧光观察Cx43在BRL 3A细胞上的分布,免疫电镜观察连接蛋白在肝细胞上的分布,Transwell共培养体系观察镉暴露受损肝细胞通过GJIC对正常肝细胞的影响。结果表明,Cd能下调BRL 3A细胞中Cx43、Cx32的表达水平以及Cx43磷酸化水平(p<0.05或p<0.01),动物试验也证实Cd可下调Cx32的表达。GJIC抑制剂GA与Cd联合处理加剧了Cd致CI的下降,提示GA加剧了Cd的细胞毒性。镉暴露细胞可导致与之相邻的正常细胞损伤,添加Sal以及GJIC抑制剂GA可明显减轻镉暴露受损细胞对正常细胞的毒性损伤作用。Sal可抑制Cd对GJIC的相关影响。提示Cd引起的GJIC抑制具有双重作用,保护正常细胞免受Cd暴露细胞的毒性损伤作用以及进一步加强Cd对镉暴露受损细胞的毒性作用。3、GJIC参与调节钙离子通路介导的镉致大鼠肝脏毒性损伤为了探讨钙离子通路在镉致大鼠肝细胞损伤中的作用以及红景天苷的保护机制,本试验通过体外添加钙离子通路相关抑制剂,用流式细胞术检测BRL 3A细胞内钙离子浓度、免疫印迹法检测BRL 3A细胞钙离子通路相关蛋白、实时定量PCR检测钙离子通路相关基因表达、RTCA检测细胞指数。结果表明,镉能引起BRL 3A细胞[Ca2+]i升高(p<0.01),通过添加细胞内游离钙离子螯合剂BAPTA-AM可抑制镉导致的细胞指数和细胞存活率的下降,添加Sal也有类似的作用。用EGTA螯合细胞外钙离子可抑制镉介导的胞存活率的下降,内质网钙泵抑制剂TG可促进镉介导的细胞存活率的下降(p<0.01或p<0.05)。体内和体外试验都表明镉能下调CaM mRNA的表达,说明CaM参与了重金属镉对肝细胞的毒性损伤过程。GJIC抑制剂GA单独处理可引起细胞[Ca2+]i升高,GA还进一步促进镉致BRL3A细胞钙超载,细胞外钙离子螯合剂EGTA可部分抑制镉诱导的BRL 3A细胞[Ca2+]i升高,但EGTA与GA联合则恶化镉诱导的BRL 3A细胞[Ca2+]i升高,TG单独处理就能引起[Ca2+]i的升高以及细胞成活率下降,与镉联合则进一步加剧对细胞的损伤作用(p<0.01)。表明GJIC与钙离子通路关系密切,诱导细胞[Ca2+]i升高是镉发挥细胞毒性的重要途径,镉引起的肝细胞钙超载主要是由于镉诱导细胞内钙库(尤其是内质网)的释放导致的,Sal可作为保护剂通过GJIC与钙离子通路发挥对镉致肝细胞毒性损伤的保护作用。4、GJIC参与调节MAPK通路介导的镉致大鼠肝脏毒性损伤为了探讨镉致大鼠肝细胞损伤中MAPK通路与GJIC的交互作用以及红景天苷的保护机制,本试验通过体外添加MAPK通路相关抑制剂,如ERK制剂U0126、JNK制剂SP600125、p38抑制剂SB202190,同时结合保护剂Sal、GJIC抑制剂GA,用染料划痕示踪法检测GJIC,免疫印迹法检测BRL3A细胞MAPK通路相关蛋白表达,实时定量PCR检测Cx32基因表达；RTCA检测细胞指数,Transwell共培养体系观察MAPK通路在镉暴露受损肝细胞通过GJIC对正常肝细胞损伤的影响。结果表明,镉致BRL 3A细胞以及大鼠肝细胞发生毒性损伤过程中MAPK关键信号分子ERK、JNK、p38MAPK发生磷酸化,通过添加Sal可以明显抑制ERK、JNK、p38MAPK蛋白的活化进而减轻镉的细胞毒性损伤作用。添加相关抑制剂发现,抑制ERK以及p38MAPK蛋白磷酸化可明显抑制镉诱导的BRL 3A细胞指数的下降,抑制JNK磷酸化则对细胞指数的影响较小。抑制MAPKs的活化可上调Cx32 mRNA的表达和Cx43蛋白的表达,改善镉诱导的GJIC的抑制作用,同时对镉损伤细胞通过GJIC对正常细胞的毒性损伤作用具有明显的保护作用。而抑制GJIC对镉诱导BRL 3A细胞MAPK通路的激活几乎无影响。5、细胞缝隙连接通讯在镉诱导大鼠肝细胞自噬中的作用为了探讨镉引起的自噬与GJIC的关系,本研究通过体外添加自噬特异性抑制剂羟氯喹(CQ)以及自噬诱导剂雷帕霉素(RAP),同时结合GJIC抑制剂甘珀酸(CBX),用单丹磺酰尸胺(MDC)染色法观察晚期自噬溶酶体,免疫印迹法检测自噬蛋白LC3、连接蛋白Cx43的表达,实时定量PCR检测自噬相关基因Atg-5、Atg-7、Beclin-1表达,探讨镉暴露大鼠肝细胞过程中自噬与GJIC的变化。结果表明,MDC染色证实了镉诱导BRL 3A细胞发生自噬,同时自噬相关基因Beclin-1、Atg5、Atg7表达上调(p<0.01),LC3Ⅱ蛋白表达增多,并具有明显的剂量-效应关系(p<0.01)。抑制自噬可进一步促进镉所引起的细胞指数的下降,促进自噬的结果刚好相反,提示镉诱导的自噬对细胞具有保护作用。添加GJIC抑制剂CBX可促进镉诱导的BRL 3A细胞自噬。自噬对GJIC起负调节作用,自噬促进镉引起的GJIC的下调,同时下调的还有Cx43的表达。