背景随着针对新机制和新靶点的抗肿瘤药物的研发和应用，儿童白血病的治疗不断进步。然而，抗肿瘤药物出现耐药甚至多药耐药，阻碍了当今儿童白血病的治疗进展。白血病的发生发展过程中，骨髓间充质干细胞通过直接黏附和分泌细胞因子等机制对白血病细胞增殖、分化、迁移、凋亡有重要作用。白血病细胞与骨髓微环境的相互作用成为研究儿童白血病耐药的一个重要方面。白血病的治疗不但要消灭白血病细胞，也要摧毁白血病细胞赖以生存的异常微环境。联合应用左旋门冬酰胺酶（L-asp）治疗后，儿童急性淋巴细胞白血病（ALL）的完全缓解率及长期无病生存率有了显著提高。作为儿童ALL化疗的一线药物，L-asp在ALL患儿诱导缓解中有着不可替代的地位，却容易产生耐药。对L-asp治疗的耐药与其临床疗效差存在直接相关性。关于L-asp的耐药机制，目前尚未有定论，但有研究表明，可能与白血病细胞赖以生存的骨髓微环境中骨髓间充质干细胞（MSCs）的门冬酰胺合成酶（ASNS）高表达有关。着手于干扰或切断ALL细胞与MSCs的联系，可能会找到更多解决天冬酰胺耐药问题的办法，从而改善ALL的预后。现今儿童ALL常用化疗方案中均采用长春新碱（VCR）和L-asp序贯治疗。这种序贯治疗的原则是，VCR可能有助于抑制对L-asp的过敏性反应。同时有研究发现，MSCs对抗微管药物VCR敏感。VCR预处理MSCs，能否降低MSCs中ASNS的表达并逆转共培养系统中MSCs介导的L-asp耐药，这尚有待证实。在这些研究的基础上，本项目研究以体外模拟骨髓微环境中的白血病细胞为靶点，建立共培养系统，并对其进行不同处理，即有无L-asp处理的共培养组及有无VCR预处理的L-asp处理的共培养组，通过比较不同处理的共培养组中白血病细胞的凋亡情况及白血病细胞ASNS的mRNA表达水平，评估MSCs对白血病门冬酰胺酶耐药性的影响，并探索VCR能否逆转MSCs介导的白血病细胞对门冬酰胺酶耐药及其机制，为进一步理解L-asp的化疗耐药机制并克服ALL细胞对L-asp的耐药问题奠定理论基础。目的1.体外分离急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）患儿骨髓MSCs原代细胞，长期培养观察、扩增及鉴定。2.探讨MSCs对白血病细胞株Jurkat天冬酰胺酶耐药性的影响及其机制。3.探讨VCR预处理的MSCs后，对于白血病细胞株Jurkat天冬酰胺酶耐药性的影响及机制。方法1.体外分离培养及扩增儿童ALL骨髓原MSCs原代细胞。2.应用MTT法检测白血病细胞株(Jurkat、HL-60)L-asp的IC50（50%抑制率），建立MSCs-Jurkat共培养系统，并用流式细胞仪检测不同的共培养组及单独培养组Jurkat细胞株的凋亡率。3.应用RT-PCR方法检测ASNS在不同处理的共培养组及单独培养组Jurkat细胞株中ASNS的表达水平。技术路线结果1.成功进行了ALL儿童MSCs体外分离培养扩增，并建立了不同处理的MSCs-Jurkat共培养系统。2.白血病细胞株Jurkat较HL-60对L-asp敏感，并确定Jurkat细胞株L-asp的IC50。3.共培养及不同药物处理对Jurkat细胞株凋亡率及ASNS mRNA的影响3.1L-asp对Jurkat细胞株的影响：Jurkat细胞株经L-asp处理后，细胞凋亡率及ASNS的mRNA表达水平均升高（P<0.05）；用L-asp处理共培养组（共培养组2），与无L-asp处理的共培养组1相比，Jurkat细胞株的凋亡率、ASNS的mRNA表达水平升高（P<0.05）。3.2MSCs对Jurkat细胞株的影响:共培养组1中Jurkat抗凋亡能力较单独培养组强（P<0.01），ASNS的mRNA表达水平升高（P<0.05）；共培养组2的抗凋亡能力也比L-asp处理的单独培养组强（P<0.01），ASNS的mRNA表达水平却无明显变化。3.3VCR预处理MSCs对Jurkat细胞株影响：VCR预处理及L-asp处理的共培养组3Jurkat凋亡率较共培养组2高（P<0.01），ASNS的mRNA表达水平较共培养组2无明显变化。结论1. L-asp处理单独培养组及共培养组，均可使Jurkat细胞株凋亡率升高，ASNSmRNA的表达水平上调，但共培养组细胞的凋亡率及ASNSmRNA的表达水平变化幅度较单独培养组低。说明即使在MSCs支持下，L-asp对Jurkat细胞株仍有作用，MSCs可部分抑制L-asp细胞毒性。2.MSCs与Jurkat细胞株共培养可增强Jurkat细胞株其抗凋亡能力，降低其ASNSmRNA的表达水平。3.VCR预处理MSCs，可增强共培养组中Jurkat细胞株抗凋亡能力，但其ASNSmRNA表达水平无明显变化。