第一部分化学遗传学筛选抑制斑马鱼血管生成小分子化合物目的：筛选具有抑制斑马鱼血管生成功能的小分子化合物。方法：1.Tg(flk1:EGFP)斑马鱼胚胎搜集。采用转基因斑马鱼品系Tg(flk1:EGFP),其内皮细胞表达flk1启动子控制的增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescent protein, EGFP),因而完整的脉管系统可在荧光显微镜下直接观察。斑马鱼胚胎由Tg(flkl:EGFP)纯合子或杂合子与野生型配对自然交配获得。每次交配5-6对,平均每对可获得100-150个胚胎。胚胎在28℃培养基中孵育。2.药物筛选。用于筛选的化合物库为MicroSource公司Spectrum Collection化合物库。斑马鱼胚胎置于96孔板内,在发育到受精后12-14小时阶段胚胎外膜被1.5%蛋白酶消化去除。小分子化合物溶解在0.5%DMSO中,然后分别以0.1μM、1μM和5μM的浓度添加在胚胎培养基中。作用24、48、72小时后观察胚胎大体形态、胚胎活力、血管发育、心率和循环情况。相同体积的0.5%DMSO和5gM血管生成抑制剂PD173074分别作为阴性和阳性对照。结果：共筛选出7种具有抑制斑马鱼血管生成功能药物,选出率为0.35%。它们分别是异鱼藤酮、dihydromunduletone、马兜铃酸、美伐他汀、辛伐他汀、洛伐他汀和罗伐他汀。药物的最适浓度范围在0.3μM(辛伐他汀)至10μM(马兜铃酸和罗伐他汀)之间。这7种化合物根据生物活性可归为三组：鱼藤酮类(异鱼藤酮、dihydromunduletone)、马兜铃酸和他汀类药物(美伐他汀、辛伐他汀、洛伐他汀和罗伐他汀)。进一步发现,罗伐他汀不影响代表血管发生的背主动脉和已存在血管的生长发育,提示罗伐他汀的血管生成抑制作用是特异性的而非细胞毒性。第二部分罗伐他汀抗血管生成作用机制的体外实验研究目的：探讨罗伐他汀抑制血管生成的作用机制。方法：1.内皮细胞增殖、血管小管形成和迁移实验。分别应用Promega CellTiter96(?)试剂盒、内皮细胞血管小管形成实验和Cultrex(?)细胞迁移检测评价罗伐他汀对人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cell, HUVEC)增殖、血管小管形成和迁移能力的影响。2.内皮细胞周期和凋亡检测。采用流式细胞术检测罗伐他汀对细胞周期和凋亡的影响。细胞周期检测采用PI染色,应用FlowJo软件进行参数分析；而凋亡检测则进行PI和Annexin V双染色,利用Cell Quest软件分析数据。3.内皮细胞血管生成调控基因表达检测。应用RT2Profiler基因芯片技术,观察罗伐他汀引起的HUVEC血管生成通路基因谱的差异表达。结果：罗伐他汀以浓度依赖性方式显著抑制HUVEC体外增殖(IC50,5.87μM)。同时,分别用5μM、10μM、罗伐他汀处理的内皮细胞形成的管化分支平均长度分别是对照组的91%(P=0.01)、76%(P<0.05)、7%(P<0.01)。另外,内皮细胞迁移实验发现,与对照组相比,罗伐他汀处理组HUVEC平均迁移率分别下降了79%(5μM, P<0.01),84%(10μM, P<0.01)、87%(20μM, P<0.01).流失细胞术研究发现,HUVEC在5μM罗伐他汀作用48小时后,与对照组相比G1期细胞平均数量显著上升12.5%(61.9vs49.4%,P<0.05),而S期细胞却下降了19.9%(5.4vs25.1%,P<0.05),说明罗伐他汀可诱导内皮细胞G1期阻滞。我们还发现AnnexinV和PI双阳性细胞数量显著上升了8.5%(6.1vs14.6%,P<0.05),说明药物可能诱导内皮细胞晚期凋亡增加。进一步PCR芯片检测结果显示,在HUVEC内88个人血管生成通路调控基因中,43个基因表达水平在罗伐他汀的作用下发生显著变化(大于2倍),其中包括21个下调基因和22个上调基因。在下调基因中绝大多数为促血管生成基因、如成纤维生长因子-1、肝细胞生长因子-1、血管内皮生长因子C、转换生长因子B1：与之相反,上调基因多为抑制血管生成基因如组织金属蛋白酶抑制剂-1、稳定素1等。第三部分罗伐他汀治疗前列腺癌的实验研究目的：观察罗伐他汀对人前列腺癌的治疗效果方法：1.细胞增殖检测。应用Promega CellTiter96(?)试剂盒检测罗伐他汀对人前列腺癌细胞系PPC-1细胞增殖的影响。2.免疫缺陷鼠人前列腺癌PPC-1细胞移植瘤生长抑制实验。建立人前列腺癌PPC-1细胞免疫缺陷鼠(NOD/SCID)移植瘤模型,动物随机分为对照组和罗伐他汀治疗组,每组6只。罗伐他汀以每天40mg/kg腹腔注射15天,每天记录动物一般状态、体重和肿瘤体积。3.微血管密度检测。切取肿瘤组织,免疫组化CD31染色计数肿瘤微血管密度。4.药物毒性研究。分别取心、肝、结肠、肺、肾组织HE染色显微镜下观察。结果：罗伐他汀浓度依赖性地抑制PPC-1细胞增殖(IC50.14μM)。在治疗的第15天,给药组肿瘤平均体积较对照组明显减小(802.87±306.04mm3vs1801.26±395.7mm3, P<0.01),相应地,肿瘤重量在两组中也差异显著(0.86±0.39g vs1.39±0.88g, P<0.05)。此外,给药组肿瘤切片内CD31阳性血管数量较对照组显著减少(13.7±3.5/HPF vs2.1±1.4/HPF,P<0.01)。最后,动物体重(16.2±1.86g vs18016.3±1.24g,P>0.05)和主要脏器组织病理形态也无明显差异。结论：1斑马鱼化学遗传学小分子化合物筛选是研发血管生成抑制剂以及抗癌药物的良好方法；2罗伐他汀通过抑制内皮细胞功能和改变血管生成基因表达谱抑制血管生成；3罗伐他汀利用降低肿瘤微血管密度和抗增殖双靶点作用机制安全有效地抑制小鼠体内前列腺癌的生长,从而有望成为前列腺癌治疗新药。