前言全氟辛烷磺酸（Perfluorooctane sulfonate,PFOS）是近年来引起科学家们关注的一种新型持久性有机化合物,该有机物被广泛用于机械润滑剂、涂料、农药和医药品、表面活性剂、纺织品和皮革制品表面防污剂、泡沫灭火剂等数百种工业和日用品生产领域。由于PFOS在自然界中的难降解性和生物体内的高蓄积性,其已经在生态系统中得到广泛的传播,并且正在通过食物链途径的生物浓缩和生物放大进行生物种群间的转移,最终高浓度地蓄积在食物链高位生物包括食肉动物和人体内。2004年杜邦公司“不粘锅事件”进一步引起了国内专家对PFOS的关注。PFOS分子是由17个氟原子和8个碳原子组成的烃链,烃链末端碳原子上连接一个磺酰基。这种化学结构特点使分子中烃链碳原子间的共价键不容易受到外界作用而产生断裂。研究资料表明,PFOS即使在浓硫酸或浓硝酸溶液中煮沸1小时也不分解,或在98%硫酸中经过28天PFOS浓度也未见任何降低。与以往持久性有机污染物不同,PFOS具有疏水、疏油脂特性,虽然同属于持久性有机污染物,但是不蓄积在脂肪组织中,大部分与血浆蛋白结合存在于血液中,其余分布在动物肝脏、少量分布于肌肉和脑等其它组织中。研究表明,生物体内的PFOS主要来自食物、饮水、含PFOS泡沫灭火剂气溶胶吸入或体内含PFOS系列产品的降解。有研究表明,一个70kg体重的成年人通过饮食每天摄入PFOS的量约为62.5～74.2 ng。人群血清流行病学调查显示,各国各族人群血清中均检测出不同浓度的PFOS污染,其中职业暴露人群血清中PFOS浓度高达12.83mg/L;甚至新生儿血清中也存在PFOS污染。最近研究结果显示,人类血清中PFOS生物半衰期平均为8.67年（范围为2.29～21.3年,SD=6.12）,最高达21.3年。而更值得关注的是,人体内PFOS负荷呈逐年增高趋势。日本学者的调查结果显示,在1983～1999年期间,人群血清中PFOS浓度以每年0.49 ug/L速度递增。我国沈阳地区人群血清PFOS浓度从1987年的0.03ug/L增加到2002年的22.4ug/L,15年间人群血清中PFOS浓度增加了747倍。PFOS的大鼠一次经口半数致死剂量(LD₅₀)为251mg/kg,按照WHO定义标准,PFOS应属于中等毒性物质。人群流行病学调查显示,PFOS可降低新生儿体重,并使职业人群患膀胱癌和前列腺癌的危险性增高。毒理学研究表明,PFOS可对机体的神经系统、生殖系统和内分泌系统产生损伤,并具有胚胎发育毒性和遗传毒性,表明PFOS可能为一种全身毒性物质。免疫系统是对外源性化合物最为敏感的系统之一,但是,目前对于PFOS材料引起的免疫毒性研究刚刚起步,资料甚少,现有的为数不多的研究主要集中在PFOS对某些有限的免疫指标的毒性效应上,而关于PFOS免疫毒性的系统研究未见报道。所以,全面研究PFOS的免疫毒性,了解PFOS对免疫系统的危害,阐明PFOS免疫毒性剂量—效应关系和毒作用机制,可使人们深入了解PFOS危害性,在PFOS环境安全性评价中提供科学依据。因此,本研究在观察PFOS短期染毒、亚慢性染毒和体外染毒对小鼠免疫系统毒性的基础上,应用ELISA、流式细胞分析等方法进一步探讨PFOS对小鼠细胞免疫、体液免疫、非特异性免疫等的影响,从分子水平上评价PFOS对小鼠免疫系统毒性效应。材料与方法一、试验动物染毒方式和样品制备1、PFOS配制方法:试验组配制:配制2%Tween 80溶液,按照设计剂量加入全氟辛烷磺酸钾盐（PFOS-K）配制PFOS溶液。对照组配制:配制2%Tween 80溶液。2、短期染毒8-10周的雄性C57BL/6小鼠48只,实验室内适应性喂养7天后按体重随机分为4组,每天一次经口灌胃染毒,试验组每天PFOS染毒剂量分别为5、20、40mg/kg（bw）,对照组给予2%Tween-80。每天一次经口灌胃染毒7天。3、亚慢性染毒将8-10周的雄性C57BL/6小鼠60只,实验室内适应性喂养10天后按体重随机分为6组,每天一次经口灌胃染毒60天,试验组60天PFOS累计染毒剂量[TotalAdministered Dose（TAD）]分别为0.5、5、25、50、125mg/kg（bw）,即每天染毒剂量分别为8.33、83.33、416.67、833.33、2083.33μg PFOS/kg（bw）,对照组给予2%Tween-80。4、体外染毒10周雄性C57BL/6小鼠6只,无菌取脾制备脾细胞悬液,调整脾细胞终浓度至1×10⁷/mL,取200μl/孔加入24孔培养板中。将PFOS（以DMSO为溶剂）按0、1、5、10、50、200、300μM的浓度加入24孔培养板中,37℃、5%CO₂的细胞培养箱内培养48小时,提取培养上清,检测细胞因子水平。5、脾细胞采集短期染毒后第8天或亚慢性染毒第61天,摘除眼球采血并收集血清,颈椎脱位处死小鼠,75%酒精浸泡,取出各组小鼠的胸腺、肾脏、肝脏、脾脏,称量质量,并计算器官指数。常规制备脾细胞悬液,用含2%热灭活FCS的PBS将脾细胞终浓度调至1×10⁷/mL。二、免疫指标测定方法1、血清中PFOS浓度测定0.5mL血清样品加入1.0mL 0.5mol/LTBAHS和2.5mL 0.25mol/L碳酸氢钠缓冲液,振荡混合20min后加入5.0mL MTBE进行萃取,离心后,收集上层MTBE相。沉淀物部分再次加入5.0mL MTBE,进行2次萃取。两次萃取合并液用高纯氮吹干后,准确加入1.0mL甲醇进行定容,进行HPLC/MS定量分析。2、CD4⁺、CD8⁺细胞亚群检测取0.1 mL脾细胞悬液,加入anti-CD3-FITC（553061）、anti-CD4-PE（557308）、anti-CD8-PERCP（553036）0.2μg,4℃下避光孵浴30min。加2mL PBS、混匀,离心5min（2000r/min）,弃上清。将剩余液体转入流式管。流式细胞仪的激发波长为488nm,利用FACS CELLQUEST软件获取细胞,每个样品分析10,000个细胞;记录CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞的个数百分比。3、NK细胞活性检测以YAC-1细胞作为靶细胞,调整靶细胞浓度至1×10⁵/ml备用。取脾细胞（1×10⁶/ml）和靶细胞各0.1ml加入96孔细胞培养板中,每份标本设三个复孔,同时设靶细胞自然释放对照组和最大释放对照组。用酶联检测仪在490nm波长下读各孔OD值,计算NK细胞活性。4、MTT法检测淋巴细胞增殖用含10%小牛血清的RPMI-1640培养液调整脾细胞浓度为5×10⁶/mL,加入96孔培养板,每孔100μl脾细胞悬液。每孔加入10μg/ml的ConA或LPS100μl,同时设只加培养液的阴性对照,每组设3复孔。在酶标仪上于570nm处测光吸收值（A）,以下列公式计算淋巴细胞增殖指数（SI）:SI=刺激孔A值/对照孔A值。5、NO测定取脾细胞培养上清接入96孔培养板中,100μl/孔,将100μmol/L NaNO₂在96孔培养板中进行倍比稀释。各孔中再加入0.1ml Griess试剂,室温静置10min,在550nm波长处测OD值。6、B细胞溶血空斑试验测定将绵羊红细胞（SRBC）免疫过的小鼠脾细胞制成2×10⁶/ml悬液,与0.1ml SRBC和0.05ml的DEAE右旋糖酐补体在琼脂凝胶内混合,冷却凝固后放入37℃温箱1小时,加入豚鼠血清1.5ml。记录整个平皿中溶血空斑数。7、ELISpot法检测IL-2和IL-10细胞数量采用ELISpot法检测脾脏IL-2和IL-10的细胞数量,调整脾细胞浓度分别为1×10⁵/ml（IL-2）和1×10⁶/ml（IL-10）。每孔加入100μl脾细胞悬液和对照品,37℃CO₂温箱孵育1h。每孔加100μl生物素标记的IL-2或IL-10检测抗体,4℃过夜孵育。加入碱性磷酸酯酶标记链霉亲和素100μl/孔,室温孵育2h。加入BCIP/NBT显色液100μl/孔,避光孵育1h。ELISPOT自动分析仪读板计数IL-2或IL-10细胞数量。8、ELIsA法细胞因子IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ测定采用双抗体夹心ELISA法:每孔加入50μl倍比稀释的标准品,对照品或培养上清,混匀1min。室温孵育2h。每孔加入100μl各细胞因子多克隆抗体,室温孵育2h。100μl/孔加入酶标记溶液,室温避光孵育30min。加入100μl/孔终止液。用酶标仪在450nm波长读记吸光度OD值。9、血清抗体IgG、IgM测定采用ELISA检测血清抗体水平:100μl/孔标准品加入到96孔酶标板中,每孔加入100μl血清,加入50μl/孔酶标记溶液,36℃孵育1h,每孔加入底物呈色剂A、B液各50μl,36℃孵育15min,加入50μl/孔终止液。于450nm酶标仪读取OD值。10、统计学分析采用SAS8.2统计软件进行数据的分析。对数据进行正态性检验后,用均数（Mean）和标准误（SE）描述正态分布数据的描述指标。各组数据之间比较采用单因素方差分析,采用Dunnett（?）t检验进行各个试验组与对照组的多重比较。结果1、PFOS染毒对小鼠体重、饲料消耗量和器官指数的影响短期染毒试验:对照组小鼠血清中PFOS浓度低于检测限（0.05mg/L）,PFOS染毒5、20、40mg/kg剂量组小鼠血清中PFOS浓度分别为110.46±6.18mg/L、280.65±16.33mg/L、338.01±23.92mg/L。20、40mg PFOS/kg剂量组小鼠的体重和饲料消耗量呈显著的下降趋势（p<0.05）,且脾脏指数和胸腺指数显著的低于对照组。各试验组小鼠肝脏指数均显著的高于对照组,肾脏指数变化并不显著。亚慢性染毒试验:PFOS染毒0.5、5、25、50、125mg/kg（bw）TAD剂量组小鼠血清中PFOS浓度分别为0.67±0.17mg/L、7.13±1.04mg/L、21.64±4.41mg/L、65.43±11.73mg/L、120.67±21.76mg/L,均显著的高于对照组血清PFOS水平。25、50、125mg PFOS/kg TAD剂量组小鼠的体重和饲料消耗量呈显著的下降趋势,且脾脏指数和胸腺指数显著的低于对照组。≥5mg PFOS/kg TAD剂量组小鼠肝脏指数显著的高于对照组,并随着染毒剂量的增高,肝脏指数呈增高趋势。2、PFOS对小鼠脾细胞和胸腺细胞总数及淋巴细胞亚群的影响短期染毒试验:20、40mg PFOS/kg剂量组小鼠脾细胞和胸腺细胞总数显著的降低;40mg PFOS/kg剂量组小鼠CD4⁺ CD8^-和CD4^-CD8⁺细胞亚群的数量分别减少28%和21%。亚慢性染毒试验:25、50、125mg PFOS/kg TAD剂量组小鼠脾细胞和胸腺细胞总数显著的低于对照组,其中125mg PFOS/kg TAD剂量组小鼠脾细胞和胸腺细胞总数分别减少55%和70%。CD4⁺CD8^-和CD4^-CD8⁺细胞亚群的数量显著降低。3、PFOS对淋巴细胞增殖功能的影响短期试验中,当PFOS染毒剂量≥5mg/kg/day时,可显著的抑制T淋巴细胞增殖功能,而B淋巴细胞增殖功能的抑制开始于20mg/kg/day剂量组。亚慢性毒性试验中,随着PFOS染毒剂量的增高,T、B淋巴细胞增殖功能呈先增高后降低趋势。体外试验结果显示,当PFOS暴露剂量为≥200μM时,可显著抑制B细胞增殖功能。4、PFOS对NK细胞活性的影响效应短期试验中,PFOS染毒剂量20mg和40mg/kg/day组小鼠NK细胞的活性分别为18.04±1.42和13.08±1.11,显著的低于对照组水平（50.33±4.08）。亚慢性毒性试验中,5mg PFOS/kg TAD可显著的上调NK细胞的活性,当PFOS染毒剂量≥50mg/kg TAD时,NK细胞的活性显著降低。5、PFOS对脾细胞培养上清NO产生水平影响短期试验中,仅40mg/kg/day剂量组NO水平显著的低于对照组。亚慢性试验中,NO水平随着PFOS染毒剂量的增高呈先增高后降低趋势。体外实验显示,当PFOS暴露剂量为300μM时,可显著抑制NO水平。6、B细胞溶血空斑试验测定短期试验中,5mg、20mg、40mg PFOS/kg剂量组空斑形成细胞数分别减少63%、77%和86%。亚慢性毒性试验中,当PFOS暴露剂量为5mg/kg TAD时,空斑形成细胞数可显著的低于对照组,并随着染毒剂量的增高,空斑形成细胞数呈降低趋势。7、细胞因子IL-2、IL-4、IL-10、IFN-γ测定短期试验和亚慢性试验中,随着染毒剂量的增高,IL-2和IFN-γ的水平均呈降低趋势。短期试验中IL-4呈先增高后降低趋势;而亚慢性试验中PFOS可显著促进IL-4的水平。IL-10在各剂量组间的差异并没有达到统计学意义。体外实验显示,PFOS并没有显著的抑制细胞因子的表达。8、血清抗体IgG、IgM测定短期试验中,PFOS各暴露剂量组IgM水平均显著的低于对照组,而IgG水平在5mg/kg/day剂量组显著的增高,40mg/kg/day组显著的降低。亚慢性毒性试验中,当PFOS累计染毒剂量≥5mg/kg TAD时,随着染毒剂量的增高,IgM水平呈显著下降趋势。IgG水平呈先增高后降低趋势。结论1、PFOS是与机体免疫反应相关的外源性化学物质,以5mg PFOS/kg剂量连续7天染毒小鼠时即可抑制小鼠免疫功能。2、PFOS对C57BL/6小鼠经口染毒60天可导致机体免疫系统的抑制,根据免疫指标的改变,其未观察到损害所用的剂量（NOAEL）和观察到损害作用的最低剂量（LOAEL）分别为0.5mg/kg TAD和5mg/kg TAD,对应血清中PFOS浓度分别为0.67±0.17mg/L和7.13±1.04mg/L。3、体外试验结果比表明200μM PFOS可显著的抑制脾淋巴细胞的增殖功能,表明在较高剂量水平下PFOS可对淋巴细胞产生直接毒性效应。4、根据自然人群血清中PFOS浓度不高于150μg/L计算,小鼠血清中PFOS浓度约为自然人群血清最高浓度的50倍时,可抑制机体免疫功能。