背景和目的:胎盘是胎儿的附属物,它介于胎儿和母体之间,有代谢、防御、内分泌和免疫等功能,因此是维持胎儿在宫内营养及发育的重要器官。胎盘由底蜕膜、叶状绒毛膜和羊膜三部分结构构成。晚期囊胚着床后,滋养细胞开始分裂增殖形成绒毛。绒毛由两部分组成,其内层为有丝分裂活跃的细胞滋养细胞,可以形成新的滋养细胞。其外层为执行功能的合体滋养细胞。新滋养细胞可以融合成合体滋养细胞。滋养细胞是胎盘组织中最主要的细胞。胎盘形成和发育期间,滋养层细胞群体先入侵子宫内膜基质并与毛细血管相接触,侵袭进入毛细血管后继续迁移,最后定居于母体螺旋动脉并对其结构进行重建,以确保胎儿胎盘系统得到充足的血液供应。滋养细胞的生物学行为有侵袭、增殖、分化与凋亡,这些行为受到生长因子、粘附分子、细胞因子和激素等多种因素的影响。各种细胞外刺激通过细胞内的信号传导来调节效应因子的基因和蛋白表达,从而调节细胞的生物学活性。滋养细胞的生物学行为受到严格的时空调控,一旦其调控机制失调,就可能导致流产、子痫前期、胎儿生长受限、滋养细胞肿瘤等疾病的发生,因此妊娠期滋养细胞的调控环节已成为目前产科学研究的热点。随着研究的深入,对滋养细胞的研究已经从病理学水平发展到了分子生物学水平。Rho及其下游信号分子ROCK(Rho associated colied coil forming protein)做为信号传导分子已经在较多组织和细胞中发挥作用,如在结肠癌、乳腺癌、胃癌、肝细胞癌等组织中RhoA、RhoC的表达水平及活性水平增加,促进癌细胞的增殖, RhoB则具有抗肿瘤活性的作用。早在1992年就有人发现ROCKII在胎盘组织中有表达。在2000年,有学者发现RhoA对胚胎的发育和分化起着重要作用。随之人们就开始关注Rho、ROCK在滋养细胞中的作用。在随后的研究中发现,ROCKII在子痫前期患者胎盘组织中的表达较正常妊娠者增加,我们在既往的研究过程中也发现RhoB的表达水平在子痫前期患者的胎盘中较正常妊娠者增加。可见Rho、ROCK在妊娠过程中的表达水平是不同的,因此我们通过动物实验对其动态变化规律进行了研究,为滋养细胞相关疾病的研究寻找一定的理论依据。材料和方法:1.动物模型的建立及分组将Wistar大鼠于晚上18:00按雌雄1:1合笼,次晨8:00观察饲养笼下的托盘,发现阴栓为受孕成功(有20只),并设定为妊娠第0日。将成功受孕的20只雌性大鼠随机分为5组:孕7天组、孕10天组、孕13天组、孕15天组和孕18天组。在室温25℃、相对湿度40%-70%的屏障系统内饲养,动物的饲料和饮水不受限制。2.标本的采集将孕7天组、孕10天组、孕13天组、孕15天组和孕18天组大鼠分别于妊娠第7、10、13、15、18天,在速眠新肌肉注射麻醉下,剖宫取胎盘,冰冷生理盐水洗去血迹,滤纸吸干,天平称量胎盘湿重,并记录胎盘个数及胎盘直径大小。将胎盘在无菌纱布上尽量吸干水分后,取部分胎盘组织置于4%多聚甲醛中固定,剩下的胎盘组织全部放入冻存管中,并迅速放于液氮灌内保存备用。取完标本后追加速眠新剂量将大鼠处死。3.免疫组化检测RhoA、B、C及ROCK I、II的表达孕鼠的胎盘称量测定完毕后,取部分胎盘置于4%多聚甲醛中固定24h;石蜡包埋,切片。采用免疫组化ABC法测定胎盘中RhoA、B、C、ROCKI、ROCKII的表达。一抗:RhoA1:1500、RhoB1:1500、RhoC1:1500、ROCKI 1:500、ROCKII 1:1500稀释。参照免疫组化试剂说明书,严格按照操作步骤进行。以PBS代替一抗作阴性对照,DAB显色,苏木精浅染,中性树胶封片镜检。以胞浆内出现棕黄色颗粒为阳性,用Image-Pro Plus软件进行分析。4. Western-blot检测RhoA、B、C及ROCK I、II蛋白的表达提取蛋白,BCA法蛋白定量,行蛋白电泳,电转印于PVDF膜,剪下相应的蛋白电泳条带,3% BSA室温封闭2h,加入相应的一抗(RhoA1:300、RhoB1:300、RhoC1:300、ROCKI 1:1000、ROCKII 1:1000),4℃过夜,TBS缓冲液洗膜3次,加入HRP标记的二抗,37℃孵育1h,洗膜3次;ECL(电化学发光法)显影,并用Quantity-one4.62软件(Bio-Rad Laboratories)对电泳条进行灰度值分析,以目的条带与内参照条带的比值代表目的蛋白的表达水平。5. ELISA试剂盒检测Rho/ROCK的活性严格按照试剂盒说明进行操作,测得Rho/ROCK的活性。结果:1.一般情况在整个妊娠过程中,各组大鼠精神状态较好,无死亡、流产。随着孕龄增加,大鼠胎盘重量和直径的增长情况与既往研究相符。2.免疫组化结果显示,RhoA、RhoB、RhoC、ROCKI、ROCKII在孕7、10、13、15、18天组的胎盘组织中均有表达,且主要表达在滋养细胞的胞质中。3.RhoA、B、C、ROCKI、II的表达正常妊娠的大鼠胎盘组织中RhoA表达水平在孕10、13、15、18天组显著高于孕7天组(P﹤0.05),且孕13、15、18天组较7、10天组表达水平有非常显著的差异(P﹤0.01)。随着孕龄增长,RhoA的表达水平呈上升趋势。RhoB在各妊娠时期的表达水平无明显差异(P﹥0.05)。RhoC的表达水平在孕10、13、15、18天组显著高于孕7天组(P﹤0.05),且孕13、15、18天组较7、10天组表达水平有非常显著的差异(P﹤0.01)。随着孕龄增长,RhoC的表达水平呈上升趋势。正常妊娠的大鼠胎盘组织中ROCKI、ROCKII在孕18天组表达显著高于孕7、10、13、15天组(P﹤0.01)。随着孕龄增长,ROCKI、ROCKII的表达呈上升的趋势。4. RhoA、B、C、ROCKI、II的活性水平正常妊娠的大鼠胎盘组织中RhoA活性水平在孕10、13、15、18天组显著高于孕7天组(P﹤0.05),但孕10、13、15天组间活性水平无明显的差异(P﹥0.05)。随着孕龄增长,RhoA的活性水平呈上升趋势。RhoB活性水平在孕7、10、13、15、18天组间无明显差异(P﹥0.05)。随着孕龄增加,RhoB的活性水平无明显变化。RhoC的活性水平在孕15、18天组显著高于孕7、10、13天组(P﹤0.05),而孕7、10、13天组间的活性水平无显著的差异(P﹥0.05)。随着孕龄增长,RhoC的活性水平呈上升趋势。ROCKI的活性水平在孕13、15、18天组显著高于孕7、10天组(P﹤0.01),孕10天组高于孕7天组(P﹤0.05)。随着孕龄增长,ROCKI的活性水平在增加。ROCKII的活性水平在孕18天组显著高于孕7、10、13、15天组(P﹤0.01),孕13、15天组活性水平高于孕7、10天组(P<0.05),孕7、10天组活性水平无明显差异(P>0.05)。随着孕龄增长,ROCKII的活性水平在增加,在晚孕期间增加最明显。结论:1. RhoA、RhoB、RhoC、ROCKI、ROCKII在大鼠胎盘组织中均有表达,且主要在滋养细胞的胞质中表达;2.在大鼠胎盘组织中RhoA、RhoC表达及活性水平呈上升趋势,而RhoB则无明显变化。早孕期间RhoA、RhoC参与滋养细胞的侵袭行为,在中晚孕期间可能参与滋养细胞的增殖及凋亡,其中RhoC在滋养细胞的凋亡行为中起的作用较RhoA更为明显。RhoB在正常妊娠期间可能未参与滋养细胞的侵袭、增殖、分化与凋亡;3.随着孕期的增加, ROCKI、ROCKII的表达水平及活性水平是增加的,并且都是在中晚孕期间增加最明显,尤其是ROCKII最为显著。在早孕阶段ROCKI、ROCKII均有表达,很有可能它们同RhoA、RhoC一起调节滋养细胞的侵袭行为。在中晚孕期间则协同它们调节滋养细胞的增殖与凋亡,促进胎盘的成熟,使妊娠能够顺利进行。其中以ROCKII的作用最为明显。