丙型肝炎病毒(hepatitis C vjms，HCv)感染严重影响着全球公共健康，全世界大约有17亿HCv感染者。HCv感染者中，约有80％发展为慢性丙型肝炎，至少有30％的HCv携带者发展成为更严重的肝病，如脂肪肝、肝硬化和肝癌。HCv属于黄病毒家族中的肝病毒类，其病毒颗粒由一个9．6kh的正性的单链RNA片段包装折叠而成。其基因编码区的阅读框在翻译后可形成一个由30¨00个氦基酸组成的蛋白单体。此蛋白单体在翻译后可黏附于内质网膜上，并在宿主和病毒的蛋白酶的作用下转化为3个结构蛋白(core蛋白、E1、E2)和7个非结构蛋白(p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B)。HCv可以分为7个主基因型和多个亚型。蛋白单体还可与细胞表面的特异性蛋白绑定，通过网格蛋白的内吞作用内化，从而启动生命周期。HCv core蛋白是22kDa的非糖基化蛋白，由靠近5、端的开放读码框编码。作为典型的黄病毒core蛋白，它富含赖氦酸和精氦酸(N端更明显))。它与RNA基因组结合而形成HCv病毒核衣壳。HCv core蛋白的亚细胞定位在细胞质。但当其C端缺夫时，可向核内迁移。这表明HCvcore蛋白可能在HCv致病过程中其到直接而关键的作用。长期慢性的HCv感染者体内的HCv能够影响肝细胞内脂类代谢，从而导致脂滴在肝脏中的积聚。同时，肝细胞内的脂滴在HCv生命循环中也发挥着非常重要的作用。HCv诱发脂肪肝、肝硬化最终形成肝癌的机理尚未阐明。普遍认为，HCv通过影响宿主肝细胞的脂代谢，诱发脂肪肝，并逐渐发展为肝硬化、肝癌。HCv诱发脂肪肝很可能与HCv蛋白和细胞脂代谢相关蛋白之间的相互作用有关。其中HCv的core蛋白是重要的致病因素，它涉及到脂滴累积，脂肪基因表达的改变和脂肪相关蛋白的活性。宿主基因表达对病毒生命周期有协助作用。长期肝脂肪变的存在可加速肝硬化和肝癌的进程。异常的脂代谢能够加速肝病发展，而脂滴分子在HCv复制的过程中叉发挥着关键作用。研究HCv core蛋白诱发脂肪肝的分子机制就显得尤为重要。通过阐明HCv core蛋白诱发脂肪肝的致病机理，控制感染，抑制脂肪肝的形成，并予页防疾病进一步恶化，是目前世界上研究的热点问题。值得注意的是，HCv core蛋白3a亚型与其他亚型相比，能够更加强烈地诱导肝脏脂肪变的形成，但其基因序列与其他亚型相比，只在数量极少的若干个碱基上有差异。可推测这些差异碱基中具有与肝脂肪变相关的重要序列，但其通过何种机制发挥作用尚不明了。本研究着眼于HCv core蛋白3a亚型(HCv core 3a)诱发肝脏脂肪变的分子机制。我们构建了携带HA—HCv core 3a基因的重组腺病毒，以携带HA_HCv core 1b基因的重组腺病毒作对照，感染原位灌注分离的小鼠原代肝细胞。在感染24h，48h，72h时间点，分别观察感染HCv core 3a与HCv core 1b和正常肝细胞中脂滴的形成大小，数量等形态学特点。PPAR_Ⅱ是细胞核激素受体超家族的一员，是正常脂肪细胞分化过程中所必需的。核转录因子PPAR_Ⅱ的主要功能是控制脂肪酸氧化和活化作用。：PPAR_Ⅱ缺乏会导致肝脏中脂肪酸氧化缺陷。因此，我们通过反转录和实时定量PCR技术，检测与脂代谢相关的宿主细胞受体PP．AR一Ⅱ和宿主基因ACCl和FAS酐／mRNA的表达量的变化，从而进一步探究HCv core蛋白诱导肝脏脂肪变的分子机制。【目的】1．研究HCv core 3a蛋白在小鼠原代肝细胞中表达时诱导脂滴形成的大小，数量等形态指标；2．通过实时定量PCR技术检测宿主细胞受体PPAR_Ⅱ，宿主基因ACCl和FAS的mRNA的表达量，研究HCv core蛋白与宿主细胞脂代谢之间的关系。【方法】1．构建携带HA_HCv core 3a和HA—HCv core 1b融合基因的重组腺病毒；2．通过原位灌注分离小鼠原代肝细胞培养，并制作细胞怛片；3．用携带融合基因HA—HCv core 3a和HA_HCv core 1b的重组腺病毒感染小鼠原代肝细胞；4．在24h，48h，72h的时间点分别对原代肝细胞进行免疫荧光检测，观察原代肝细胞中脂滴形成的大小，数量等形态学特点；5．培养小鼠肝细胞系AMLl2，并进行重组腺病毒的感染；6．反转录受感染细胞中的mRNA为cDNA，进行实时定量PCR检测，以探究HCv core蛋白在肝细胞内诱导脂肪变的分子机制。【结果】1．成功构建pAdEasy—HA—HCV core 3a和pAdEasy—HA—HCV core lb重组腺病毒。首先将全基因合成的HCV core 3a(1b)片段连入pCMV-HA载体中，并将HA-HCV core 3a(1b)片段整体转入穿梭质粒pshuttle—CMV中。利用穿梭质粒同源重组获得重组腺病毒质粒，经腺病毒包装和扩增获得高滴度的重组腺病毒。利用western Not技术检测融合蛋白鉴定重组腺病毒包装成功。2．相对于HCV core lb，感染HCV core 3a重组腺病毒的小鼠原代肝细胞形成的脂滴增大，数量增加。用pAdEasy—HA—HCV core 3a和pAdEasy—HA—HCV core lb重组腺病毒感染小鼠原代肝细胞24h，48h，72h。结果显示，pAdEasy—HA-HCV core3a与pAdEasy—HA-HCV core lb感染相比，前者能够诱导形成体积较大的脂滴，并且脂滴数量明显增加。HCV core lb与正常肝细胞相比也能诱导数量较少的脂肪变。3．感染pAdEasy—HA—HCV core 3a重组腺病毒的小鼠肝细胞中PPAR—n的mRNA的表达量明显低于pAdEasy—HA—HCV core lb感染的肝细胞以及正常原代肝细胞，同时ACCl表达量有所升高，但FAS的表达量变化不明显。用pAdEasy—HA—HCV core 3a和pAdEasy—HA—HCV core lb分别感染小鼠肝细胞系AMLl2。24h后利用实时定量PCR技术检测PPAR-ct，ACCl和FAS的mRNA含量。发现3a亚型感染与1b亚型感染和正常细胞相比，PPAR-ct的表达量明显降低。而ACCl表达量有所升高，但亚型之间相差不大，而FAS的mRNA的表达量变化不大。【结论】本研究发现HCV core 3a在细胞水平上诱导肝脏细胞脂肪变的作用比HCV core lb更强。在脂滴大小和数量上部可以明显地看出此趋势，其中HCV core 3a组脂滴大小为HCV core lb组脂滴大小的4～6倍。HCVcore蛋白可能通过降低宿主细胞PPAR-a等相关蛋白的表达量发生作用，诱导脂滴形成，诱发肝脏脂肪变。