研究背景表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)是一种跨膜糖蛋白,是蛋白激酶超家族的成员之一。该蛋白作为表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)家族成员的受体,能够与EGF等配基相结合并激活下游细胞内信号转导通路。在众多EGFR细胞内信号转导通路中,KRAS/RAF/MEK/ERK以及PI3K/AKT通路是其中最重要的两条通路。正常情况下EGF等配基与受体的结合可引起受体的二聚化以及酪氨酸的自体磷酸化,并主要通过以上两条通路最终调节细胞的增殖、迁徙、存活以及血管形成等生命活动。EGFR信号转导通路由于在恶性肿瘤的发生和发展过程中起着重要作用,因而成为分子靶向治疗的重要靶点,针对EGFR及其下游信号转导通路相关生物分子的研究及药物开发已成为研究热点。在结直肠癌分子靶向治疗方面,最具代表性的药物当属抗EGFR单克隆抗体(单抗),如西妥昔单抗和帕尼单抗。研究表明,KRAS基因在抑制肿瘤细胞凋亡及加速其增殖方面起着重要的作用。通过抗EGFR单抗的临床应用,研究者发现KRAS基因状态是预测抗EGFR单克隆抗体疗效的有效指标。相关研究表明KRAS基因的突变能引起抗EGFR单抗治疗失败。近年来完成的多项Ⅱ期和Ⅲ期临床试验证明,在使用抗EGFR单抗治疗转移性结直肠癌时,只有KRAS基因为野生型的患者才能从治疗中受益。对此,美国临床肿瘤协会认为,所有准备接受抗EGFR单抗治疗的转移性结直肠癌患者,在接受治疗前都应当接受KRAS基因状态的检测,抗EGFR单抗靶向治疗的对象应限制为野生型KRAS基因的结直肠癌患者。然而多数临床实践表明,在接受抗EGFR靶向治疗的野生型KRAS基因患者中,并非全部病人可从此项治疗中获益,仍然有相当一部分病例治疗无效。这提示仅仅依据KRAS基因状态不能很好地预测抗EGFR单抗靶向治疗的疗效,据此筛选抗EGFR单抗治疗的目标人群不可能完全准确。除了病人肿瘤组织的KRAS基因状态外,可能还存在其他因素决定着EGFR靶向治疗的疗效,如EGFR信号转导通路中其它基因的突变状态等。因此,如何通过临床特征、病理特征以及基因突变方面的研究预测抗EGFR治疗的疗效并筛选治疗对象,是抗EGFR单抗用于临床后受到广泛关注并迫切需要解决的临床问题。既往研究所得出的结果显示,BRAF、PIK3CA均是结直肠癌遗传突变的靶点且与EGFR靶向治疗疗效相关。有鉴于此,了解转移性结直肠癌患者EGFR信号转导通路中其他基因的突变情况也有助于预测EGFR靶向治疗的疗效。继KRAS之后,已有研究提出可以将BRAF基因状况也作为选择抗EGFR单抗治疗目标人群的指标。目前国外有关KRAS和BRAF基因在结直肠癌中突变频率的研究较多,而关于EGFR和PIK3CA基因状态的研究相对较少。关于EGFR通路中的基因突变状态与未接受EGFR靶向治疗患者的总生存率之间关系的研究资料也不充分,且研究结果不一致。在这些研究中,多数只针对通路中某一个基因突变状态进行探讨,不能全面说明EGFR信号转导通路中基因突变与患者生存率之间的关系。另外,针对中国人结直肠癌患者的此类研究则更少见。由于基因状态在不同人种之间存在明显差异,一项针对肺癌的全球多中心靶向治疗临床研究已经证实,这种差异可导致分子靶向治疗疗效的显著差异。因此,有必要对中国人群EGFR信号转导通路中相关基因状态及其对预后的影响进行研究。目前临床上在对转移性结直肠癌患者KRAS基因状态进行检测以预测EGFR靶向治疗疗效时并未对原发灶和转移灶加以甄别,由于恶性肿瘤具有明显的异质性,可能存在原发灶和转移灶基因型不一致的情况。肿瘤异质性导致基因型或基因表达产物的不一致,早已被研究者关注。Italiano采用免疫组化和FISH方法研究非小细胞肺癌EGFR蛋白表达及基因状态,发现原发灶和转移灶的不一致。Kalikaki在对非小细胞肺癌的研究中发现,EGFR和KRAS基因状态在原发灶和转移灶之间并不一致。Oliveira的研究显示,结直肠癌淋巴结转移灶的KRAS突变频率较原发灶的高,这些结果提示仅以原发灶基因状态推断转移灶的情况并不完全准确。肝脏是结直肠癌最常见的转移靶器官,据统计,约20%的初治病人伴有肝转移,50%的病人在治疗过程中出现肝转移,70%的尸解病例发现肝转移,肝转移是结直肠癌的最重要致死原因,也是临床工作中的治疗重点。由于KRAS基因状态影响着转移性结直肠癌抗EGFR单抗治疗的疗效,因此了解结直肠癌肝转移灶与原发灶KRAS基因状态是否有一致性就显得尤为重要。用于KRAS基因突变的检测方法主要包括：PCR-SSCP测序(single strand conformation polymorphism analysis)、KRAS突变体富集PCR测序法(mutant-enriched PCR coupled sequencing)、焦磷酸突变体测序法(pyrosequencing)、双脱氧序列测定(dideoxy sequencing)、实时定量PCR(Real-timequantitative PCR)和PCR斑点杂交法(PCR-dot blot hybridization)等。不同检测方法的敏感度不一样,可能造成检测结果的差异。Whitehall的研究显示,在将样本DNA进行统一提取的情况下,采用6种不同检测方法得到KRAS突变频率最低的为32.9%,最高的达59.5%,虽然排除了所有6种方法在DNA提取过程的差异,仍然只有62.2%(46/74)的样本测试结果是一致的。除了方法学差异外,DNA质量和样本中肿瘤细胞的相对含量也是决定检测结果的重要因素,以上这些因素在基因突变检测工作中应加以重视。根据已有的研究成果和存在问题,本研究设计以下内容：(1)通过同时检测转移性结直肠癌患者EGFR,KRAS,BRAF和PIK3CA基因的突变状态,了解中国患者人群中这些基因突变的频率,以及其对未接受靶向治疗的转移性结直肠癌患者生存情况的预测价值。(2)为了解转移灶与原发灶KRAS基因突变状态的差异,进行结直肠癌原发灶与相应的肝转移灶KRAS基因突变状态的研究,并进一步探讨肿瘤的异质性对EGFR靶向治疗可能造成的影响。(3)为了解不同检测方法对结果的影响,对本研究中使用的KRAS突变体富集PCR测序法和焦磷酸突变体测序法进行了初步的对比研究。期望通过以上这些研究,为中国人群结直肠癌患者的EGFR靶向治疗及个体化治疗提供参考资料。研究方法1. EGFR、KRAS、BRAF及PIK3CA突变频率的检测从2030位结直肠癌患者中筛选出61例随访资料完整的转移性结直肠癌患者,提取出其病理样本中的DNA,并设计引物,运用PCR方法将EGFR、KRAS、BRAF、PIK3CA基因最常见的突变所在外显子扩增。采用焦磷酸测序仪配套的单链纯化装置从PCR反应液中分离单链DNA；将测序反应板放置于测序仪中进行测序。然后采用焦磷酸测序仪配套的分析软件进行数据分析,首先进行SNP分析,对于存在杂合子的位点,需进一步进行基因频率(AQ)分析,从而检测出61例样本中四种基因各自的突变率。2.临床病理学参数及基因突变对患者生存率的预后价值应用Kaplan-Meier生存分析的统计学方法分析总生存率与KRAS、BRAF及PIK3CA基因突变状态、年龄、性别、肿瘤原发部位、转移部位、转移灶数目以及治疗方案等变量之间的单变量关系,同时应用Cox比例风险回归模型评估KRAS、BRAF及PIK3CA基因突变对生存情况的预后意义,以及经过对年龄、性别、肿瘤原发灶部位、转移灶部位、转移灶数量和治疗方案等因素进行标准化转换后的预后意义。3.结直肠癌原发灶与肝转移灶KRAS基因状态的研究收集手术切除及活检所得的结直肠癌原发灶及其肝转移灶的肿瘤标本46例,从每个标本中切取10张10μm的切片,对切片中肿瘤部位进行标记,显微切割分离出已标记好的肿瘤组织,提取出样本中的DNA,并设计引物,采用突变体富集PCR测序法检测KRAS基因中12、13号密码子的突变状态,从而分析比较原发灶样本及相应肝转移灶样本中KRAS基因突变情况的差异。4.两种KRAS基因检测方法的比较研究选择肿瘤样本量充足且经过突变体富集PCR测序法检测的13例样本,进行焦磷酸测序法对比检测,初步观察两种不同的检测方法对结果的影响；两种检测方法所采用的标本收集过程略有不同,突变体富集配对PCR测序法检测的样本使用显微切割技术进行收集,与焦磷酸测序法检测的样本相比有较高的肿瘤细胞含量。研究结果1. EGFR. KRAS、BRAF及PIK3CA基因突变频率61例样本中,在EGFR的19和21号外显子上未检测到突变,KRAS、BRAF、PIK3CA基因出现突变的例数分别为12(19.7%)、3(4.9%)、3(4.9%),其中仅有1位患者同时出现两种基因突变(KRAS和PIK3CA)。2.临床病理学参数及基因突变对患者生存率的预后价值Cox单变量回归模型分析结果提示在年龄、性别、肿瘤原发灶部位、转移灶数量、转移部位、治疗方案以及KRAS、BRAF和PIK3CA三种基因突变状态等各因素中,仅有年龄、转移灶数量以及治疗方案是生存时间的重要预后因素。年龄低于65岁的患者有较高的死亡风险(HR) (HR 2.083, P=0.042);与有3个或3个以上多发转移灶患者相比,仅有1个转移灶的患者死亡风险显著降低(HR 0.537,P=0.004)；接受综合治疗患者的死亡风险显著降低(HR 0.399,P=0.001)。PIK3CA、BRAF和KRAS基因突变与患者死亡风险无相关性。根据治疗方案、基因突变、转移灶部位及数量分组的Kaplan-Meier生存函数分析结果提示PIK3CA、BRAF和KRAS三种基因不同状态的患者之间,总生存率无统计学差异。引入KRAS、BRAF及PIK3CA基因突变状态、年龄、性别、肿瘤原发部位、转移部位、转移灶数目以及治疗方案等变量的Cox模型多变量分析结果提示,只有治疗方案(P=0.001)以及年龄(P=0.017)是死亡风险比的独立预测因素。3.结直肠癌原发灶与肝转移灶KRAS基因状态的研究46例原发灶及其相应肝转移灶肿瘤样本中,原发灶癌组织中18例(39.1%)KRAS基因为突变型,肝转移灶癌组织中19例(41.3%)KRAS基因为突变型。18例原发灶癌组织KRAS基因为突变型的标本,其对应的肝转移灶标本仅有1例KRAS基因为野生型：28例原发灶癌组织KRAS基因野生型的标本,其对应的肝转移灶标本仅2例KRAS基因为突变型。统计学分析表明,原发灶与肝转移灶KRAS基因状况无统计学差异(P=0.833)。4.两种KRAS基因检测方法的比较研究对13例样本进行的突变体富集PCR测序法和焦磷酸测序法对比测试结果表明,突变体富集PCR测序法检测出KRAS基因突变型样本8例,而焦磷酸测序法检测出KRAS基因突变型样本6例,结果间无统计学差异(P=0.440)；但2例突变体富集PCR测序法测出KRAS突变型的样本,采用焦磷酸测序法未能检测出突变。研究结论1. EGFR的19和21号外显子上未检测到突变,与国外报道相符。而采用焦磷酸测序法检测所得结果显示KRAS、BRAF和PIK3CA基因较国外报道的突变频率低,提示中国人群中可能有更多的转移性结直肠癌患者适合接受抗EGFR单抗靶向治疗。与此同时,也不能排除检测方法和标本处理对结果的影响。尽管EGFR信号转导通路中这四个基因突变对于未接受EGFR靶向治疗的转移性结直肠癌患者而言,可能并非是重要的预后标志,但检测基因突变对于选择接受EGFR靶向治疗的患者而言,却具有非常重要的意义。2. EGFR信号转导通路中的KRAS、BRAF和PIK3CA基因突变状态与患者的预后无显著的相关性。即使应用多变量分析的方法将其他可能的影响因素标准化后,仍然得出相同的结果。单因素分析显示在各项临床病理参数及基因突变状态中,年龄、转移灶数量和治疗方案与预后具有很好的相关性,年龄高于65岁、转移灶数量少以及接受多学科综合治疗的患者有较好的预后。3.通过检测结直肠癌原发灶及肝转移灶的KRAS基因突变状态发现,原发灶与肝转移灶中KRAS基因状态并不完全一致,但原发灶与肝转移灶KRAS基因状况的差异无统计学意义。这一结果表明KRAS基因突变在结直肠癌原发灶与肝转移灶之间有较高的一致性,有助于指导抗EGFR单抗的临床应用。为获得更有说服力的结果,还有待于进行更大样本的研究。4.突变体富集PCR测序法和焦磷酸测序法的初步对比研究表明,检测结果无统计学差异。但2例突变体富集PCR测序法测出KRAS突变型的样本,采用焦磷酸测序法未能检测出突变。除方法本身的因素外,这一结果还可能与研究中采用不同的标本处理方法有关。