研究背景:胆管癌(CCA)是仅次于肝细胞癌的第二常见肝胆系统肿瘤,预后差,其总体发病率在世界范围内呈上升趋势。对于早期CCA患者,手术切除是首选的治疗方案,但只有部分患者(约35%)适合于具有疗效的外科切除。因此,更好地深入了解CCA的分子特征和生物学行为将有助于寻找新的分子靶点治疗CCA。血管生成是由已有的血管系统形成新的血管过程,已成为恶性肿瘤的一个公认标志。肿瘤通过生成的血管提供营养和氧气维持迅速的生长和转移。血管内皮生长因子A(VEGFA)在肿瘤血管生成中起着关键作用,并与许多实体癌的肿瘤血管密度有关。高微血管密度(MVD)的实体瘤患者比低微血管密度的实体瘤患者生存期短。抗血管生成治疗已被临床应用于各种实体瘤,包括CCA。尽管如此,抗血管生成治疗对癌症的临床疗效仍不令人满意,而且临床副作用、细胞毒性、耐药和患者复发率均较高。因此,迫切需要理解血管生成的新机制。GATA结合蛋白6(GATA6)是GATA结合蛋白家族的一员,包含两个高度保守的含锌指转录因子。在胚胎发育期间GATA6对心血管系统、消化系统和其他组织的增殖、分化和发育至关重要。肿瘤发生与胚胎期基因激活密切相关,GATA6的过度表达可促进胃癌、结直肠癌、乳腺癌以及胆管癌的进展。一些研究表明GATA6与肿瘤血管生成有关,但其分子机制尚未研究。赖氨酰氧化酶样蛋白2(LOXL2)是细胞外基质(ECM)修饰酶LOX家族的成员,其家族包括原型LOX和四种不同的LOX样蛋白(LOXL1、LOXL2、LOXL3和LOXL4)。LOXL2的C端区域负责其酶活性,N端包含四个富含半胱氨酸结构域的清道夫受体(SRCR),这些区域被认为与蛋白质-蛋白质相互作用有关。已有研究表明,核内LOXL2可与某些转录因子协同调节上皮间质转换(EMT),促进肿瘤转移。此外,靶向抑制LOXL2可降低肿瘤和眼科疾病的血管生成。然而,在CCA中LOXL2的血管生成机制尚未研究。结肠癌转移相关基因1(MACC1)在2009年首次通过全基因组在人类结肠癌组织和转移组织中搜索差异表达的基因而被发现。既往已有报道,MACC1 mRNA表达可能是结直肠癌、肺腺癌、胰腺癌、肝门部胆管癌复发及无病生存的独立预后指标。MACC1通过肝细胞生长因子(HGF)/c-Met/MAPK信号通路促进癌细胞的增殖、迁移和侵袭性。先前的研究表明MACC1参与胃癌和宫颈癌的血管生成。然而,MACC1与CCA中血管生成的相关性尚未被研究。在我们的第一部分研究中,我们使用生物信息学分析表明GATA6可能与VEGFA的启动子区域结合。我们证实了GATA6转录调控了VEGFA的表达,并阐明了一种新的CCA血管生成机制,LOXL2与GATA6结合,上调VEGFA的表达,促进血管生成和肿瘤生长。在第二部分研究中,我们也发现CCA中MACC1和VEGFA显著上调,并且MACC1和VEGFA表达水平呈正相关,我们进一步证实了MACC1调控VEGFA的表达和分泌,促进了CCA细胞的血管生成。研究方法:第一部分1.分析TCGA和GEO数据库中GATA6和LOXL2的mRNA表达,以及与VEGFA的相关性。2.收集2013年至2016年西南医院手术切除91例CCA和31例癌旁患者的样本。这些患者术前或术后均未接受放疗或化疗。通过中国芯超公司将91例癌组织和31例癌旁石蜡样品组织制作成组织芯片(TMA),采用免疫组化方法分析GATA6、LOXL2、VEGFA和MVD(CD34)在TMA上的表达水平。3.采用Kaplan-Meier曲线和Cox回归分析GATA6/LOXL2表达与总生存率和无病生存率之间的相关性。在TMA中分析了GATA6/LOXL2表达与VEGFA表达和MVD的相关性。4.实时定量qPCR和Western Blotting检测干预GATA6和LOXL2表达后对VEGFA的影响。用激光共聚焦扫描显微镜检测GATA6和LOXL2在胆管癌细胞的共定位。采用免疫共沉淀法(Co-IP)分析了GATA6与LOXL2的相互作用。采用双荧光素酶报告基因和染色质免疫沉淀法(ChIP)分析了GATA6与LOXL2转录激活VEGFA。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测VEGFA的分泌水平。通过基质胶血管形成实验检测对血管生成的影响。5.我们构建了两个缺失或保留SRCR结构域的LOXL2缺失突变体(Flag-LOXL2-Δ1:删除氨基酸548-774;Flag-LOXL2-Δ2:删除氨基酸1-547)和全长LOXL2(Flag-LOXL2-full),以进一步探讨LOXL2和GATA6之间的相互作用位点。Co-IP实验检测不同的LOXL2突变体与GATA6的相互作用,并用双荧光素酶报告基因检测不同的LOXL2突变体对VEGFA启动子活性影响。6.我们利用裸鼠皮下肿瘤进一步验证GATA6/LOXL2复合体对VEGFA的调控及对血管生成、肿瘤生长的影响。通过手术切除皮下肿瘤,然后进行测量。肿瘤切片后行苏木精-伊红(HE)和IHC染色。第二部分1.TCGA(网址:https://cancergenome.nih.gov/)和GEO(网址:https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)的数据,进入编号:GSE76297,GSE89749,数据库是免费公开下载的。比较CCA组织与正常组织间MACC1和VEGFA的mRNA表达差异,并分析MACC1与VEGFA表达的关系2.2010年至2016年在西南医院肝胆外科接受手术的122例CCA患者中,有31例癌旁组织标本。2018年手术中获得7例成对的CCA和癌旁组织,并立即保存在液氮中。所有患者均未接受新辅助化疗或肝移植。采用real-time qPCR和Western blot技术检测7对CCA中MACC1和VEGFA的表达水平。采用免疫组织化学方法(IHC)检测石蜡包埋CCA样品中MACC1、VEGFA和MVD(CD34)的表达水平。3.采用Kaplan-Meier曲线和Cox回归分析MACC1和VEGFA表达与总生存率的关系,分析MACC1表达与VEGFA表达及MVD的关系。4.采用real-time qPCR和Western blot检测干预MACC1表达对VEGFA的影响。通过共聚焦激光扫描显微镜检测MACC1和VEGFA表达的定位。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测VEGFA的分泌水平。HUVECs成管实验分析各组血管腔形成的差异。研究结果:第一部分1.数据中分析发现GATA6和LOXL2的mRNA表达在胆管癌中上调,并且与VEGFA的表达相关。2.免疫组化分析表明GATA6主要在细胞核表达,而LOXL2在细胞核和细胞质中均都表达。两种蛋白染色方法的评分只计算核内表达。在TMA中所有癌旁标本的胆管上皮GATA6、LOXL2和VEGFA染色均为阴性。在TMA中的癌组织,38例GATA6和LOXL2弱阳性或强阳性样本定义为双阳性,标记为GATA6/LOXL2阳性;28例定义为双阴性,标记为GATA6/LOXL2阴性。VEGFA表达在细胞浆中。免疫组化观察到VEGFA阳性表达(35/66)和阴性表达(31/66)。CD34在血管内皮细胞中表达并标记MVD。在38个GATA6/LOXL2阳性和28个GATA6/LOXL2阴性染色样本中,MVD的平均值(定义为截止值)为23.69/mm~2。免疫组化观察到高MVD(40/66)和低MVD(26/66)。3.Kaplan-Meier分析显示,与GATA6/LOXL2阴性的CCA患者相比,GATA6/LOXL2阳性的CCA患者总生存率更差(log rank P=0.01),无病生存率更短(log rank P=0.02)。利用Cox回归分析评估年龄、性别、肿瘤位置、TNM分期和GATA6/LOXL2表达的危险比(HRs),我们观察到GATA6/LOXL2的表达是总生存率和无病生存率的独立预测因子(HR=1.871,95%CI=1.070-3.271,P=0.028;HR=1.781,95%CI=1.013-3.129,P=0.045)。另外,TNM期(Ⅲ~Ⅳ)是总生存率和无病生存率的另一个独立预测因子(HR=2.333,95%CI=1.311~4.150,P=0.004;HR=1.861,95%CI=1.053~3.291,P=0.033)。在TMA中的同一样本,我们观察到38个GATA6/LOXL2阳性组织中有25个(65.8%)VEGFA阳性组织,27个(71.1%)高MVD组织。因此,GATA6/LOXL2与VEGFA(P=0.02)和MVD(P=0.04)呈正相关。4.细胞实验表明GATA6和LOXL2敲除可显著降低QBC939细胞中的VEGFA蛋白水平,GATA6和LOXL2过表达可增加RBE细胞中的VEGFA蛋白水平。在CCA细胞中也观察到相同的mRNA水平变化。共聚焦激光扫描显微镜检测表明,GATA6位于细胞核内,LOXL2位于细胞核和细胞质内。这些结果与CCA组织的IHC结果一致。免疫共沉淀实验证实了GATA6和LOXL2在CCA细胞系中相互结合,通过这种相互作用转录调节VEGFA的表达和分泌,促进了血管的形成。5.基于Co-IP实验结果,在CCA细胞中,GATA6与LOXL2的SRCR结构域结合不依赖于催化结构域。并且,Flag-LOXL2-Δ1和Flag-LOXL2-full增加了VEGFA启动子活性;然而,LOXL2-Δ2没有增加VEGFA启动子活动。此外,QBC939细胞中GATA6或LOXL2的下调降低了LOXL2与GATA6的相互作用。基于这些结果,说明LOXL2的SRCR域与GATA6相互作用,增加VEGFA启动子活性。6.体内分析进一步验证了GATA6/LOXL2可促进VEGFA的表达、血管生成和肿瘤生长。第二部分1.与正常对照组织相比,数据集中CCA组织和配对的癌旁组织中MACC1和VEGFA显著上调。在TCGA、GSE76297和GSE89749数据集中,MACC1与VEGFA显著相关。2.与癌旁组织比较,7例冰冻CCA组织中MACC1和VEGFA的蛋白和mRNA水平均升高。免疫组化显示,CCA患者中,MACC1高表达和VEGFA高表达分别为53.3%(65/122)和54.9%(67/122)。MACC1/VEGFA共同高表达43例,MACC1/VEGFA共同低表达33例。然而,所有31例癌旁组织中MACC1和VEGFA均为低表达。122例CCA患者中,高MVD 56例(45.9%),低MVD 66例(54.1%)。3.Kaplan-Meier分析显示,MACC1和VEGFA的高表达与总生存率降低显著相关(log-rank P<0.01和P<0.05)。MACC1-高/VEGFA-高表达组的总体生存率也低于MACC1-低/VEGFA-低表达组(log-rank P<0.001)。Cox回归分析显示,MACC1和淋巴结转移是CCA患者总体生存的独立预测因子。高MACC1表达的CCA组织中有66.2%(43/65)高表达VEGFA(P<0.01),高MACC1表达的CCA组织中有60%(39/65)高MVD。4.激光共聚焦扫描显微镜显示,MACC1和VEGFA在胞质和细胞核中均有表达。Western blotting和real-time qPCR证实敲除MACC1可显著下调两种CCA细胞系VEGFA的蛋白和mRNA表达。ELISA结果表明,MACC1敲除显著降低了VEGFA的分泌水平。HUVECs成管实验显示,在两组CCA细胞中,MACC1敲低组的条件培养基的成管数均显著低于对照组(P<0.01和P<0.01)。研究结论:总之,我们的研究证明了一种新的分子机制,即LOXL2和GATA6相互作用促进血管生成,复合体结合在VEGFA的启动子区域从而增强VEGFA的表达,促进了血管生成以及促进肿瘤生长。小分子细胞渗透性抑制剂治疗CCA以及患者分层的预后标记候选可能具有很大的价值。除此之外,我们也发现CCA中MACC1和VEGFA表达上调,而MACC1和VEGFA的高表达预示着较差的生存率,并且MACC1是一个独立的生存预测因子,通过上调VEGFA促进CCA血管生成。